Summary
우리는 HeLa 세포를 사용 하 여 포유류 세포 주기 동안 이중 가닥 RNA 바인딩 단백질 키 니 아 제 RNA 활성화 (PKR)의 공부 RNA-인터에 대 한 실험적인 접근을 제시. 이 방법은 포름알데히드 crosslink RNA PKR 단지 및 PKR 바인딩된 RNAs를 풍부 하 게 하는 immunoprecipitation를 사용 합니다. 이러한 RNAs는 더 높은 처리량 시퀀싱 또는 qRT-PCR을 통해 분석할 수 있습니다.
Abstract
단백질 키 니 아 제 RNA 활성화 (PKR) 타고 난 면역 반응 단백질의 회원 이며, 바이러스 성 RNAs의 더블-좌초 이차 구조를 인식 합니다. 때 바이러스 이중 가닥 RNAs (dsRNAs)에 바인딩된, PKR는 이합체 화 및 후속 autophosphorylation를 겪 습. Phosphorylated PKR (pPKR) 활성화 되 고 진 핵 개시 요인 2 (eIF2α) 글로벌 번역 억제의 알파 소 단위의 인 산화를 유도 한다. PKR 세포 주기 동안과 같은 생리 적인 조건 하에서 또는 감염 없이 다양 한 스트레스 조건 하에서 활성화 될 수 있다 제안 증거를 증가. 그러나, PKR의 RNA 활성 제에 대 한 우리의 이해를 캡처하고 dsRNAs PKR 상호 작용 분석 표준화 된 실험 방법의 부족으로 인해 제한 됩니다. 여기, 우리는 실험 현재 구체적으로 풍부 하 고 PKR 분석 프로토콜 바인딩된 RNAs HeLa 세포를 사용 하 여 세포 주기 동안. 우리는 PKR RNA 복합물을 수정 하 고 immunoprecipitation를 통해 그들을 격리 포름알데히드의 효율적인 가교 활동을 활용 합니다. PKR 공동 immunoprecipitated RNAs 높은 처리량 시퀀싱 라이브러리를 생성 하기 위해 추가 처리 수 다음. 세포질 dsRNAs PKR 상호 작용의 1 개의 주요 클래스는 미토 콘 드 리아 RNAs (mtRNAs), 무거운 가닥 빛 가닥 RNAs는 보완 상호작용을 통해 intermolecular dsRNAs 존재할 수 있습니다. 공부 하 고 이러한 이중 mtRNAs의 strandedness, 또한 선물이 가닥 특정 qRT-PCR를 위한 프로토콜. PKR 바인딩된 RNAs의 분석을 위해 우리의 프로토콜 최적화 하지만 셀룰러 dsRNAs 또는 다른 dsRNA 바인딩 단백질의 RNA 인터 공부를 쉽게 수정할 수 있습니다.
Introduction
단백질 키 니 아 제 RNA 활성화 (PKR), 일컬어 진 핵 개시 요인 2 알파 니 2 (EIF2AK2), RNAs에 의해 제공 된 정보를 전송 하는 특징이 잘 단백질 키 니 아가입니다. 그것은 진 핵 번역 개시 2 소 단위 알파 (eIF2α)에 속하는 키 가족 고 떠들고 51 글로벌 번역1을 억제 하는 감염에 대 한 응답에서에서 eIF2α phosphorylates. 이러한 맥락에서 PKR PKR 이합체 화 및 autophosphorylation2에 대 한 플랫폼을 제공 하는 바이러스 성 더블-좌초 RNAs (dsRNAs)에 의해 활성화 됩니다. EIF2α, 외 PKR 수 phosphorylate 또한 p53, 인슐린 수용 체 기질 1, 억제 물 κB, 및 c 6 월 N 맨끝 키 니 아 제 (설립) 수많은 신호 변환 통로3,,45의 활동을 규제 하 6.
PKR 원래 소아마비의 dsRNAs7,8를 인식 하 여 소아마비 감염 시 eIF2α phosphorylated 키로 확인 되었다. PKR은 점점 면역 반응을 넘어 다각적인 역할을 발견 하 고 그것의 탈 선 활성화 또는 오작동 수많은 인간의 질병에서 함축 된다. 활성화/Phosphorylated PKR (pPKR) 자주 apoptosis 동안 관찰 하 고 퇴행 성 질환, 헌팅턴의 같은 특히 신경 퇴행 성 질환, 파 킨 슨 병의, 그리고 알 츠 하이 머 병9 환자의 일반적인 특성은 ,,1011,,1213. 또한, PKR 대사 스트레스와 열 충격14,15,,1617등 다양 한 스트레스 조건 하에서 활성화 됩니다. 다른 한편으로, PKR의 금지 증가 세포 증식에도 악성 변환18,19결과입니다. PKR 함수는 또한 정상적인 뇌 기능에 중요 한 이며 pPKR의 수준으로 세포 주기 동안 높은 M 단계20,,2122동안. 이러한 맥락에서 pPKR와 글로벌 번역을 억제 키 mitotic 신호 시스템에 적절 한 세포 분열20에 필요한 단서를 제공 합니다. 또한, PKR의 장기간된 활성화 G2/M 단계에 중국 햄스터 난소 세포 주기 검거 세포23에서 결과. 따라서, PKR 인 산화는 M/g 1 전환21동안 빠른 비활성화 되도록 부정적인 피드백 루프에 의해 통제 된다.
PKR의 넓은 범위 기능에도 불구 하 고 PKR 활성화에 대 한 우리의 이해를 캡처하고 dsRNAs PKR 활성화할 수 있는 식별 표준화 높은 처리량 실험적인 접근의 부족으로 인해 제한 됩니다. 이전 학문은 보여주었다 PKR dsRNAs 두 거꾸로 Alu 반복 (IRAlus)20,24, 그러나 세포 주기 동안 또는 PKR을 활성화할 수 있는 추가 셀룰러 dsRNAs의 존재의 가능성에 의해 형성 된와 상호 작용할 수 있습니다. 인간 세포에 스트레스 조건 탐험 되지 않았습니다. RNA-인터 RNA 의무적인 단백질 (RBP)의 식별에 기존의 접근 crosslink RNA RBP 단지25,,2627에 UV 빛을 사용 합니다. 최근 연구 마우스 시스템에 자외선 가교 이렇게 적용 하 고 확인 작은 nucleolar RNAs 대사 스트레스16동안 PKR 활성화를 조절할 수 있습니다. 활용 하 여 포름알데히드의 높은 가교 효율, 우리는 HeLa 세포28에서 세포 주기 동안 상호 작용 하는 PKR RNAs를 식별 하는 대체 방법 제시. 비슷한 접근 방식은 공부 스타 우 펜 및 Drosha29,,3031같은 다른 dsRBPs에 적용 되었습니다. 우리와 같은 짧은 산재 된 핵 성분 (사인), 긴 interspersed 핵 요소 (선), 내 인 성 레트로 바이러스 요소 (ERV), 그리고 심지어 알파 위성 RNAs PKR noncoding RNAs의 다양 한 종류 상호 작용 수 있습니다 발견. 또한, 우리는 PKR 미토 콘 드 리아 RNAs (mtRNAs), 어떤 양식을 intermolecular dsRNAs 무거운 물가 빛 사이의 상호 보완 작용을 통해 물가 RNAs28와 상호 작용할 수 있습니다 보였다. 최근 간행물은 더 일부 mtRNAs 이중 형태로 존재 하 고 흑색 종 분화 관련 단백질 5 interferons32유도 등 dsRNA 센서를 활성화할 수 있습니다 우리의 데이터 지원. 더 중요 한 것은, 식 및 mtRNAs의 subcellular 지 방화는 변조와 다양 한 스트레스에 의해 세포 주기 동안는 PKR 활성화28을 조절 하는 기능에 중요 한 있을 수 있습니다.
이 문서에서는 최근에 개발 된 포름알데히드 가교 및 immunoprecipitation (fCLIP)에 대 한 자세한 프로토콜 소개 캡처 및 세포 주기 동안 상호 작용 하는 PKR RNAs를 분석 하는 방법. 티 미 딘 및 nocodazole를 사용 하 여 세포 주기 검거 샘플을 준비 하는 방법을 보여 줍니다. 우리는 다음 PKR 바인딩된 RNAs 및 방법 이러한 RNAs를 식별 하기 위해 높은 처리량 시퀀싱 라이브러리를 준비 하 분리 fCLIP 프로세스를 제시. 또한, 우리는 PKR 바인딩된 RNAs qRT-PCR를 사용 하 여 분석 하는 자세한 절차를 나타냅니다. 특히, 우리는 mtRNAs의 strandedness를 분석 하는 물가 관련 반전 녹음 방송 절차 제시. 설명된 프로토콜은 HeLa 세포 및 PKR, 최적화 하지만 셀룰러 dsRNAs 공부 하거나 다른 dsRBPs의 RNA 인터 식별 키 단계의 세포 주기 샘플, fCLIP, 및 물가 관련 qRT-PCR 분석 준비 쉽게 수정할 수 있습니다.
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Protocol
1. 솔루션 및 세포 준비
- 솔루션 준비
- 세포 배양에 대 한 준비 매체 헬러 세포 배양에 대 한 소 태아 혈 청 (FBS) 50 mL를 추가 하 여 500 mL Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)의.
참고: 항생제는 세포 배양에 추가 될 수 있지만 우리는 항생제를 사용 하지 않습니다. - 0.1 %paraformaldehyde 대 1에서 4% (w/v) paraformaldehyde 분해 x Phosphate-Buffered 염 분 (PBS) 난방 및 희석 뜨거운 접시에 1 x PBS를 추가 하 여 0.1% (v/v) paraformaldehyde 30 mL를 만들려고.
주의: 증기 두건에서 모든 단계를 수행 하 고 paraformaldehyde 솔루션 비등 하지 않도록 주의 하십시오. 빛에서 0.1%의 솔루션을 보호 하 고 4 ° c.에 저장 솔루션을 사용 하 여 1 개월 이내.
참고: 마지막 0.1% (v/v) paraformaldehyde 해결책의 pH는 약 7 이어야 한다. - FCLIP 세포의 용 해 버퍼 준비: 20 mM Tris HCl (pH 7.5), 15 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.5% (v/v) nonidet-p40 (NP-40), 0.1% (v/v) 트라이 톤 X-100 0.1% (v/v) 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS), 및 0.1% (w/v) 나트륨 deoxycholate. 트리플 증류수 (TDW) 40 mL를 추가 합니다. 4 ° c.에 게
- FCLIP 워시 버퍼 준비: 20 mM Tris HCl (pH 7.5), 150 m m NaCl, 10 mM EDTA, 0.1% (v/v) NP-40, 0.1% (v/v) 트라이 톤 X-100, 0.1% (v/v) SDS, 및 0.1% (w/v) 나트륨 deoxycholate. TDW 40 mL를 추가 합니다. 4 ° c.에 게
- PK 버퍼 x 4 준비: 400 mM Tris HCl (pH 7.5), 200 mM NaCl, 40 m m EDTA, 그리고 4% (v/v) SDS. TDW 40 mL를 추가 합니다. 실내 온도에 상점.
- FCLIP 차입 버퍼 준비: PK 버퍼, 우 레 아의 21 g 및 TDW 8.5 mL x 4의 20 mL. 신선한 준비.
- RNA 차입 버퍼 준비: 0.3 M NaOAc와 2% (w/v) SDS. 실내 온도에 상점.
- RNA 로드 염료 x 2 준비: 0.025% (w/v) bromophenol 블루, 0.025% (w/v) 자일 렌 cyanol, 5 mM EDTA, 0.05% (w/v) SDS, 및 95% (v/v) formamide. -20 ° c.에 게
- 1 x TBE 버퍼 준비: 0.089 M Tris-붕 산 염 및 0.002 M EDTA. TBE 버퍼의 500 mL를 준비 합니다.
- 세포 배양에 대 한 준비 매체 헬러 세포 배양에 대 한 소 태아 혈 청 (FBS) 50 mL를 추가 하 여 500 mL Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)의.
- S 또는 M 단계 체포 셀의 준비
- 씨앗 ~ 750000 또는 ~ 1000000 헬러 각각 S 또는 M 단계 체포 샘플에 대 한 세포. 24 h에 대 한 37 ° C, 5% CO2 세포 성장.
- 2mm 티 미 딘 셀 하 고 37 ° c.에 18 h에 대 한 품 어
- 두 번 PBS로 세포 세척. 신선한 미디어를 추가 하 고 37 ° c.에 9 h에 대 한 품 어
- S 단계 체포 셀, 셀 2mm 티 미 딘을 취급 합니다. M 단계 체포 셀, 셀 100 ng/mL nocodazole 취급 합니다. 15 h 37 ° C와 수확 셀에서 품 어.
참고: 세포 주기 샘플의 동질성 확인할 수 있습니다 FACS를 사용 하 여.
2. 포름알데히드 cross-linking 및 immunoprecipitation
- 셀 수확
- S 단계 샘플에 대 한 15 mL 원뿔 튜브에 세포 스 크레이 퍼와 전송 셀을 수집 합니다. M 단계 샘플, M 단계 체포 세포를 분리 하 여 15 mL 원뿔 튜브로 그들을 전송 셀 문화 접시의 측면을 누릅니다.
참고: M 단계 체포 셀의 동질성을 늘리려면 셀 스 크레이 퍼를 사용 하지 마십시오. - 원심 380 x g 3 분 제거에 대 한 실내 온도에서 세포는 상쾌한 고 다시 차가운 PBS와 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 전송의 1 mL와 함께 일시 중단.
- 원심 4 ° C에서 10000 x g 에서 셀 30 미 제거에는 상쾌한 완전히.
- S 단계 샘플에 대 한 15 mL 원뿔 튜브에 세포 스 크레이 퍼와 전송 셀을 수집 합니다. M 단계 샘플, M 단계 체포 세포를 분리 하 여 15 mL 원뿔 튜브로 그들을 전송 셀 문화 접시의 측면을 누릅니다.
- 포름알데히드 가교
- 세포를 해결 하기 위해 실 온에서 10 분 동안 0.1 %paraformaldehyde 750 μ를 추가 합니다.
- 250 μ 1 M 글리신의 추가 하 고 반응을 풀기 위해 상 온에서 추가 10 분을 품 어. 원심 4 ° C에서 10000 x g 에서 셀 30 미 제거에는 상쾌한 완전히.
- 다시 1 mL의 PBS로 일시 중단 합니다. 10, 000에서 세포를 원심 30 s 및 제거는 상쾌한 4 ° C에서 g x.
- 다시 0.2% (v/v) protease 억제제와 2% (v/v) RNase 억제제 보충 하는 fCLIP 세포의 용 해 버퍼의 400 μ와 일시 중단 합니다. 10 분 동안 얼음에 incubate 고 sonicate는 ultrasonicator를 사용 하 여.
- ~ 150 m m NaCl 농도 조정 하려면 5 M NaCl의 11 μ를 추가 합니다. 짧게 소용돌이 및 15 분에 대 한 21,130 x g 4 ° C에서 원심 분리기는 상쾌한 미리 냉장된 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 전송.
참고: 입력된 샘플으로 상쾌한 새로운 원심 분리기 튜브에서의 40 μ를 유지 합니다. 4 ° c.에 입력된 샘플 저장
- Immunoprecipitation
- 1.5 mL microcentrifuge 관으로 단백질 A 구슬의 20 μ를 추가 합니다.
- 워시 fCLIP 세포의 용 해 버퍼의 400 μ와 구슬. 원심 1 분 제거를 위한 4 ° C에서 1000 x g 에서 비즈는 상쾌한 고 fCLIP 세포의 용 해 버퍼의 400 μ를 신중 하 게 추가 합니다. 3 반전 하 여 부드럽게 다시 중단 구슬 ~ 4 번.
- 세 번 세척 단계를 반복 합니다. 최종 세척 후에 상쾌한을 완전히 제거 합니다.
- 다시 fCLIP 세포의 용 해 버퍼의 300 μ에 비즈를 일시 중단 합니다. ~ 150 m m NaCl 농도 조정 하려면 5 M NaCl의 8.3 μ를 추가 합니다. PKR 항 체의 10 μ를 추가 하 고 3 h 4 ° c.에 회전에 대 한 품 어
- 원심 1 분 제거를 위한 4 ° C에서 1000 x g 에서 비즈는 상쾌한 고 fCLIP 워시 버퍼의 400 μ를 추가 합니다. 3 반전 하 여 부드럽게 다시 중단 구슬 ~ 4 번.
- 두 번 세척 단계를 반복 합니다. 최종 세척 후에 상쾌한을 완전히 제거 합니다.
참고: 소용돌이 믹서를 사용 하지 마십시오. 손으로 부드럽게 튜브를 반전. - Lysate의 300 μ를 추가 하 고는 회전에 4 ° C에서 3 시간 품 어.
참고: 더 이상 보육 시간 증가 배경 바인딩을 발생할 수 있습니다. - 원심 1 분 제거를 위한 4 ° C에서 1000 x g 에서 비즈는 상쾌한 고 fCLIP 워시 버퍼의 400 μ를 추가 합니다. 3 반전 하 여 부드럽게 다시 중단 구슬 ~ 4 번.
- 세 번 세척 단계를 반복 합니다. 최종 세척 후에 상쾌한을 완전히 제거 합니다.
- FCLIP 차입 버퍼의 300 μ를 추가 합니다. 구슬에서 PKR elute를 25 ° C에서 3 h thermomixer에서 품 어.
참고: fCLIP 차입 버퍼 신선한 준비. - 실 온에서 1000 x g 에서 centrifuge 하 고 깨끗 한 시 관에는 상쾌한 전송.
참고: microcentrifuge 관은 또한 좋다, 하지만 시 튜브 드 가교 단계 (단계 2.3.12) 증발을 방지 하기 위해 선호 된다. - 가수분해 K의 300 μ (20 mg/mL)을 추가 하 고 65 ° c.에서 밤새 품 어
참고: 온수 커버는 thermomixer를 사용 하 여 증발을 피하기 위해.
- RNA 추출
- 1 시간 동안 37 ° C에서 30 미 품 대 산 페 놀 클로 프롬 및 소용돌이의 580 μ를 추가 합니다.
- 30 s와 10 분 동안 실 온에서 12000 x g 에서 원심 분리기와 동.
- Microcentrifuge 깨끗 한 1.5 mL 튜브에 상위 계층을 전송 합니다. 3m NaOAc, coprecipitant (예: Glycoblue)의 0.5 μ와 소 프로 파 놀의 동일한 볼륨의 1/10 볼륨을 추가 합니다. -20 ° c.에서 밤새 품 어
- 1 시간에 4 ° C에서 최대 속도로 centrifuging 여 펠 릿을 침전.
참고: 경우 RNA/DNA 펠 릿 했다 하지, RNA/DNA 펠 릿은 관찰 될 때까지 coprecipitant와 추가 1 h. 계속이이 단계에 대 한 원심 분리기의 추가적인 0.5 μ를 추가 합니다. - 제거는 상쾌한 고 75% 에틸 알코올의 1 mL를 추가 합니다. 5 분에 4 ° C에서 12000 x g 에서 원심 분리기에서 한 번 더 세척 단계를 반복 합니다. 상쾌한을 완전히 제거 하 고 건조 한 실 온에서 펠 릿.
- 1 시간 동안 37 ° C에서 TDW, DNase 나 버퍼의 5 μ, RNase 억제제의 1 μ DNase I. 품 어의 2 μ의 42 μ를 추가 합니다.
- TDW의 150 μ와 200 μ 산 페 놀 클로 프롬의 추가 합니다. 10 분 동안 실 온에서 12000 x g 에서 30 s. 원심 분리기에 대 한 소용돌이.
- Microcentrifuge 깨끗 한 1.5 mL 튜브에 상위 계층을 전송 합니다. 3 M NaOAc, coprecipitant의 0.5 μ 그리고 100% 에틸 알코올의 1 mL의 20 μ를 추가 합니다. 밤새-80 ° c.에 품 어
- 펠 릿을 침전 하 고 단계 2.4.4 2.4.5에에서 설명 된 대로 75% 에틸 알코올로 씻어.
- 다시 TDW의 적절 한 금액에서을 일시 중단 합니다.
3. 시퀀싱 라이브러리 준비
- rRNA 제거
- 다시 단계 2.4.10 TDW의 28 μ에서에서 RNA 펠 릿을 일시 중단 합니다.
참고: 총 RNA의 최대 금액 미만 5 μ g 이어야 한다. - RRNA를 제거 하는 rRNA 제거 키트의 참조 가이드에서 제공 하는 절차를 따릅니다.
- RRNA 청소 자석 구슬의 160 μ를 추가 하 여 RNAs를 고갈.
- ~ 15 회를 pipetting으로 혼합 하 고 15 분 동안 실 온에서 품 어.
- 마그네틱 바에 튜브를 부착 하 고 제거는 상쾌한.
- 구슬과 마그네틱 바에 여전히 연결 되어 30 품 어 하는 동안 추가할 수 80% 에틸 알코올의 300 μ s.
- 신선한 300 μ 솔루션에 에틸 알코올 바꿉니다. 공기 건조 실 온에서 12 분 동안 자기 바에 구슬.
- 다시 일시 중단 구슬 TDW와 섞어 12 μ에 15 번 pipetting으로.
- 마그네틱 바에 비즈를 연결 하 고 깨끗 한 PCR 튜브에는 상쾌한 이동.
- 고갈 고갈 키트 rRNA에서 제공 하는 절차를 따라 조각난된 리보솜 RNAs (rRNAs) 합니다.
- 마그네틱 구슬 및 반복 단계 3.1.3.1 3.1.3.6의 110 μ를 추가 하 여는 RNAs를 정리.
- 다시 단계 2.4.10 TDW의 28 μ에서에서 RNA 펠 릿을 일시 중단 합니다.
- RNA 라벨 및 어댑터 결 찰
- RRNA 고갈 RNAs에 10 x CIAP 버퍼의 2 μ, RNase 억제제의 1 μ 그리고 남극 알칼리 성 인산 가수분해 효소의 2 μ를 추가 합니다. 그리고 5 분은 인산 가수분해 효소 비활성화 65 ° C에서 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어.
- 추가 10 x PNK 버퍼의 3 μ, RNase 억제제의 1.5 μ, T4 PNK 효소, r-ATP의 0.8 μ 그리고 TDW의 1.7 μ의 1.5 μ. 50 분 동안 37 ° C에서 품 어.
- 10mm ATP의 1.5 μ를 추가 하 고 추가 40 분 동안 37 ° C에서 품 어.
- RNA 차입 버퍼의 170 μ를 추가 하 여 반응을 중지 합니다.
- 10 분 동안 실 온에서 12000 x g 에서 30 s. 원심 분리기에 대 한 산 페 놀 클로 프롬 및 소용돌이의 200 μ를 추가 합니다.
- Microcentrifuge 깨끗 한 1.5 mL 튜브에 상위 계층을 전송 합니다. 3 M NaOAc, coprecipitant의 0.5 μ 그리고 100% 에틸 알코올의 1 mL의 20 μ를 추가 합니다. 밤새-80 ° c.에 품 어
- 펠 릿 RNA 침전 하 고 단계 2.4.4 2.4.5에에서 설명 된 대로 75% 에틸 알코올로 씻어. TDW의 4.5 μ에서 다시 중단 하십시오 고 RNA 로드 염료 x 2의 9 μ를 추가 합니다.
- 95 ° C 5 분 및 10% 우 레 아-페이지 젤에 부하에서 샘플을 열.
- 370 V 40 분에 젤을 실행 합니다.
참고: 미리 샘플을 로드 하기 전에 370 V 90 분에 젤을 실행 합니다. - ~ 100-500 뉴클레오티드 지역에서 젤 고 젤을 휴식.
- 0.3 M NaCl의 700 μ를 추가 하 고는 회전에 4 ° C에서 밤새 품 어.
- 열을 5 분 동안 실 온에서 최고 속도로 원심 분리기 솔루션을 전송 합니다.
- Microcentrifuge 깨끗 한 1.5 mL 튜브에는 eluate 전송. 3m NaOAc, coprecipitant의 0.5 μ와 소 프로 파 놀의 동일한 볼륨의 1/10 볼륨을 추가 합니다. -20 ° c.에서 밤새 품 어
- 3' 어댑터 결 찰
- 펠 릿 RNA 침전 하 고 단계 2.4.4 2.4.5에에서 설명 된 대로 75% 에틸 알코올로 씻어.
- 다시 TDW의 6.5 μ에 RNA 알 약을 중단 하 고 10 μ M 3' 어댑터의 1 μ를 추가 합니다.
- PCR 튜브에 솔루션을 전송 하 고 2 분 동안 70 ° C에서 품 어.
- 10 x 결 찰 버퍼 1 μ, RNase 억제제의 0.5 μ 그리고 T4 RNA 리가 2의 1 μ를 추가 합니다. 1 시간, 6 시간, 25 ° C 그리고 22 ° C 6 h 28 ° C에서 품 어.
- 5 분 동안 95 ° C에서 RNA 로딩 염색과 열 x 2의 12 μ를 추가 합니다.
- 젤 정화 3' 어댑터 출혈 RNAs 3.2.9 3.2.13에 설명 된 대로.
- 5' 어댑터 결 찰
- 펠 릿 RNA 침전 하 고 단계 2.4.4 2.4.5에에서 설명 된 대로 75% 에틸 알코올로 씻어.
- 다시 TDW의 4.2 μ에 RNA 알 약을 중단 하 고 5 μ M 5' 어댑터의 1 μ를 추가 합니다.
- PCR 튜브에 솔루션을 전송 하 고 2 분 동안 70 ° C에서 품 어.
- 10 x 리가 버퍼, RNase 억제제, 10mm ATP, T4 RNA 리가 1의 0.8 μ의 0.8 μ의 0.4 μ의 0.8 μ를 추가 합니다. 1 시간, 6 시간, 25 ° C 그리고 22 ° C 6 h 28 ° C에서 품 어.
- 반전 녹음 방송 및 PCR 증폭
- 5' 어댑터에 합자 RNAs는 4 μ M 반전 녹음 방송 뇌관의 1 μ를 추가 합니다. 2 분 동안 70 ° C에서 품 어 고 즉시 4 ° c
- 5 x FS 버퍼 4 μ, 2.5 m m dNTP의 4 μ, 0.1 m M DTT, RNase 억제제의 1 μ 및 역전사의 1 μ 1 μ를 추가 합니다. 50 ° C 1 시간 및 15 분 동안 70 ° C에서 품 어.
- PCR 확대 준비
- RT 제품의 믹스 1 μ, 25 μ M RPI 뇌관의 1 μ, 25 μ M RP1 뇌관의 1 μ, HF 버퍼, 2.5 m m dNTP의 4 μ, TDW, 32.5 μ x 5 10 μ 그리고 높은 중 합 효소의 0.5 μ.
- PCR 프로그램 11 실행 ~ 13 주기.
참고: PCR에 대 한 프로그램은: 98 ° C 30에 대 한 뜨거운 시작, 98 ° C 10 s s, 60 ° C 30에 대 한 s와 45 72 ° C 확대, 그리고 5 분 동안 72 ° C에 대 한 s. 증폭 단계 11-13 사이클 반복 됩니다.
- 마그네틱 구슬과 다음 단계 3.1.3.1 3.1.3.6의 40 μ를 사용 하 여 하지만 TDW의 10 μ elute DNA를 사용 하 여 PCR 제품을 청소.
- 10 x DNA 로드 염료의 2 μ를 추가 합니다. 6% 아크릴 아 미드 젤에 샘플을 로드 하 고 200 V 30 분 실행 합니다.
- 실 온에서 5 분 동안 Sybr 골드 (0.01% (v/v) 1 x TBE 버퍼에) 얼룩.
- 드 실 온에서 5 분 동안 1 x TBE 버퍼에 얼룩.
- ~ 200-700 뉴클레오티드 지역에서 젤 고 젤을 휴식.
- 0.3 M NaCl의 700 μ를 추가 하 고 밤새 elute DNA를 실 온에서 품 어.
- 열 및 5 분 동안 실 온에서 최고 속도로 원심 분리기에 모든 것을 로드 합니다.
- Microcentrifuge 깨끗 한 1.5 mL 튜브에는 eluate 전송. 3m NaOAc, coprecipitant의 0.5 μ와 소 프로 파 놀의 동일한 볼륨의 1/10 볼륨을 추가 합니다. -20 ° c.에서 밤새 품 어
- 펠 릿 DNA를 침전 하 고 단계 2.4.4 2.4.5에에서 설명 된 대로 75% 에틸 알코올로 씻어. TDW의 20 μ에서 다시 일시 중단 합니다.
- 시퀀서를 사용 하 여 샘플을 분석 합니다.
4. qRT-PCR를 사용 하 여 상호 작용 하는 PKR RNAs의 분석
- 방법 1: 임의의 hexamer 반전 녹음 방송
- 다시 단계 2.4.10 TDW의 8.5 μ에서에서 RNA 펠 릿을 일시 중단 하 고 PCR 튜브에 솔루션을 전송.
- 100 μ M 임의의 hexamers의 0.5 μ와 2.5 m m dNTP 혼합의 4 μ 추가 합니다.
- 열에서 65 ° C 5 분 하 고 즉시 솔루션 적어도 1 분 동안 얼음에 품 어.
- 혼합 반응 확인: 5 x SSIV 버퍼 4 μ, 100 m DTT, RNase 억제제의 1 μ 그리고 역전사 (200 U/μ)의 1 μ m의 1 μ. 반응 혼합 RNA 솔루션에 추가 합니다.
- 23 ° C 10 분, 10 분, 50 ° C에서 혼합물을 품 어와 10 분 동안 80 ° C.
- 실시간 PCR 시스템을 사용 하 여 cDNA를 분석 합니다.
참고: 실시간 PCR 위한 프로그램은: 뜨거운 시작, 5 95 ° C에 대 일 분 동안 95 ° C s와 60 ° C 10에 대 한 확대, 그리고 95 ° C 30에 대 한 s s, 30 위한 65 ° C s, 그리고 95 ° C 30에 대 한 용융에 대 한 s. 증폭 단계 40 주기 반복 됩니다.
- 방법 2: 물가 관련 반전 녹음 방송
- 반전 뇌관의 마스터 믹스 준비: ~ 20 뉴클레오티드 유전자 특정 시퀀스의 뒤에 동일한 양의 유전자 특정 반전 녹음 방송 뇌관 CMV 발기인 순서를 포함 하는 혼합.
참고: 모든 유전자 특정 RT 뇌관의 결합된 농도 4 μ M. - 다시 단계 2.4.10 TDW의 8.5 μ에서에서 RNA 펠 릿을 일시 중단 하 고 PCR 튜브에 솔루션을 전송.
- 반전 녹음 방송 뇌관의 4 μ M 마스터 믹스와 2.5 m m dNTP 혼합의 4 μ의 0.5 μ를 추가 합니다.
- 열에서 65 ° C 5 분 하 고 즉시 솔루션 적어도 1 분 동안 얼음에 품 어.
- 5 x SSIV 버퍼 4 μ, 100 m DTT, RNase 억제제의 1 μ 그리고 역전사 (200 U/μ)의 1 μ m의 1 μ를 혼합 하 여 반응 솔루션을 준비 합니다. RNA 뇌관 혼합 반응 솔루션을 추가 합니다.
- 50 ° C 10 분 및 10 분 동안 80 ° C에서 솔루션을 품 어.
- 실시간 PCR 시스템을 사용 하 여 cDNA를 분석 합니다.
참고: 실시간 PCR 위한 프로그램은 방법 1에 설명 된 것과 동일 합니다.
- 반전 뇌관의 마스터 믹스 준비: ~ 20 뉴클레오티드 유전자 특정 시퀀스의 뒤에 동일한 양의 유전자 특정 반전 녹음 방송 뇌관 CMV 발기인 순서를 포함 하는 혼합.
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Representative Results
HeLa 세포의 세포 주기 S 또는 M 단계에서 체포 하는 과정에 대 한 개략도 그림 1에 표시 됩니다. M 단계 체포 샘플, 우리 명확 하 게 둥근 모양의 세포 (그림 2A) 현미경을 시각화할 수 있습니다. 세포 주기 검거의 효율성 검토, FACS (그림 2B)를 사용 하 여 셀의 핵 콘텐츠를 분석 수 있습니다. 그림 3 은 D7F7 항 체 immunoprecipitate PKR에 뛰어난 능력을 보여준다 immunoprecipitation 효율 테스트에 대 한 대표적인 데이터를 보여준다. Immunoprecipitation 효율에이 차이 두 다른 PKR 항 체 (그림 4)를 사용 하 여 준비 하는 높 처리량 연속 라이브러리의 클래스 분포에 불일치에 반영 수 있습니다. D7F7 항 체의 특이성은 더 PKR immunoprecipitate (그림 5A)와 총 세포 lysate (그림 5B)의 전체 오 점 부 분석을 사용 하 여 확인 됩니다. 그림 6 은 높은 처리량 시퀀싱 라이브러리 준비 시 rRNAs 제거 전후 동위 신호를 보여준다. 그림 7 RNAs 공동-토끼 IgG 또는 DiGeorge 증후군 염색체 지구 8 (DGCR8)와 immunoprecipitated에만 RNAs 공동-PKR와 함께 immunoprecipitated mtRNAs의 풍부를 보여준다. 그림 8 특정 대표 스트랜드를 보여줍니다 qRT-PCR 분석 S 또는 M 단계에 PKR 바인딩된 mtRNAs의 샘플을 체포.
그림 1: 준비 세포 주기 검거 샘플에 대 한 도식. (A, B) S (A) 또는 M (B) 단계 체포 HeLa 세포의 준비의 설계도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 세포 주기의 분석 샘플 체포. (A) S 또는 M 단계 체포 샘플 이미지를 단계. 막대는 250 μ m을 나타냅니다. (B) FACS 분석 샘플의 핵 콘텐츠를 보여주는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: PKR 항 체에 대 한 Immunoprecipitation 효율 테스트. PKR 바인딩된 RNAs의 성공적인 농축, D7F7 항 체 등 최종 immunoprecipitation 효율을 가진 항 체를 사용 해야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: RNA 시퀀싱 라이브러리 다른 PKR 항 체를 사용 하 여 준비의 클래스 분포. FCLIP에 대 한 다른 PKR 항 체를 사용 하 여 매핑된 시퀀싱 읽기의 다른 클래스 배포 결과. 불일치는 immunoprecipitation 효율성의 차이로 인해 높습니다. 이 그림은 김 외.28에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: D7F7 PKR 항 체의 특이성. (A, B) PKR immunoprecipitated (A) 또는 (B) 총 헬러 lysate의 서 부 전체 오 점 분석이 보여주었다 PKR의 크기에 해당 하는 하나의 강한 밴드 D7F7 항 체는 매우 구체적인 인식 PKR에서 나타내는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: PKR 공동 immunoprecipitated RNAs에 대 한 방사성 신호. (A) PKR 공동 immunoprecipitated RNAs는 그들의 5' 끝 r-ATP를 라벨에 의해 검출 될 수. Radioistope 신호 (B) 감소는 성공적인 rRNA 제거 시 관찰 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: PKR mtRNA 상호 작용의 유효성 검사. 표시 된 항 체와 RNAs 공동-immunoprecipitated mtRNAs의2 배 농축 로그인. PKR 공동-immunoprecipitated RNA 샘플만 mtRNAs의 강한 농축을 보였다. 토끼 IgG와 DGCR8 항 체는 부정적인 컨트롤으로 사용 되었다. 이 그림은 김 외.28에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8: PKR 바인딩된 mtRNAs의 물가 관련 qRT-PCR 분석. (A, B) 물가 관련 반전 녹음 방송 했다 공동-immunoprecipitated S (A) 또는 M (B) 단계 체포 셀 PKR와 mtRNAs의 strandedness 분석 하 사용 되었다. 이 그림은 김 외.28에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
S 또는 M 단계 체포 샘플을 준비 하는 과정은 그림 1에 나와 있습니다. S 단계에서 셀을 체포, 우리 어디 우리가 두 번 높은 체포 효율 (그림 1A)를 보장 하기 위해 사이 9 h 출시와 함께 티 미 딘과 세포 치료 티 미 딘 더블 블록 메서드를 사용 합니다. M 단계 체포, 우리 한번 티 미 딘과 세포 치료 9 h 릴리스 및 nocodazole prometaphase (그림 1B)에 블록 셀에 적용. 세포 주기 샘플 준비에서 하나의 핵심적인 단계 첫 번째 티 미 딘 블록 후 릴리스 단계가입니다. 티 미 딘을 완전히 제거 하려면 적어도 두 번 신선한 PBS로 세포 세척에 중대 하다. 부적절 한 세척 및 잔여 티 미 딘 증가 고 감소 세포 생존 능력에 발생할 수 있습니다. M 단계 체포의 성공 라운드 모양의 셀 (그림 2A)의 수에 있는 증가에 따라 시각적으로 확인할 수 있습니다. 그러나, M 단계 샘플 여전히 그들의 형태에 따라 많은 interphase 셀을 포함 합니다. M 단계 체포 셀만 수집, 우리는 M 단계 세포 표면에서 분리를 물리적 힘 적용. 수확된 세포의 핵 콘텐츠 추가 S 단계와 M 단계 체포 샘플 (그림 2B) 4n에 날카로운 피크 2n 4n 사이 넓은 피크를 보여준 FACS를 사용 하 여 시험 되었다. 헬러 세포를 약 24 h의 2 배 시간 제시 프로토콜 최적화 되어 있습니다. 이중 티 미 딘 및 티 미 딘 nocodazole 블록의 아이디어는 다른 세포 라인에 적용할 수 있습니다 하지만 정확한 약물 치료 및 릴리스 기간 대상 셀의 2 배 시간에 따라 최적화가 필요 합니다.
우리는 포 름 알 데히드와 가교 된 PKR RNA 복합물 PKR 작용 RNAs를 식별 하 고 immunoprecipitation를 통해 그들을 풍성 하 게. 이후 분석의 정확도 결정 하는 핵심 요소는 immunoprecipitation의 효율성입니다. 높은 처리량 시퀀싱 라이브러리 준비에 대 한 항 체를 결정 하기 위해 PKR 단백질의 다른 epitopes를 대상 하는 수많은 항 체 테스트 했습니다. 그림 3에서 같이, 우리는 dsRNA 바인딩 도메인 및 캡처 PKR에서 뛰어난 능력을 보여 촉매 도메인 사이 링커 지구를 인식 하는 D7F7 항 체 발견. 다른 항 체 (밀리) 그림 3 표시 된 N 맨끝 영역을 인식 하지만 immunoprecipitating PKR에서에서 가난한 능력을 보여줍니다. 따라서, 밀리 항 체를 사용 하 여 준비 하는 높 처리량 연속 라이브러리 포함 게놈, 특히 특정 지역28에 뚜렷한 축적 없이 introns에에서 걸쳐 분산 되어 있는 많은 배경 시퀀싱 읽기 (그림 4). 두 연속 라이브러리에 불일치 immunoprecipitation 단계 동안 PKR 캡처에 항 체의 능력의 차이로 인해 주로 생각 합니다. 우리는 추가 전체 오 immunoprecipitate (그림 5A) 및 총 헬러 lysates (그림 5B)의 서 부 분석을 통해 D7F7 PKR 항 체의 특이성을 검사합니다. 두도 말, 우리만 PKR에 해당 하는 한 강한 밴드 관찰. 이 D7F7 항 체는 매우 구체적인 가능성이 D7F7 항 체를 사용 하 여 얻은 시퀀싱 데이터 PKR의 진정한 RNA 인터 반영을 나타냅니다.
높은 처리량 시퀀싱 라이브러리 준비 하는 동안 중요 한 단계는 rRNAs의 제거 이다. 이후 우리는 포 름 알 데히드와 가교 된 RNA RBP 단지, 우리는 세포의 완전 한 세포는 ultrasonicator 사용. 이 프로세스는 rRNA를 사용 하 여 rRNA 제거의 효율성 감소 rRNAs의 조각화 제거 키트 결과. 이 문제를 해결 하려면 우리는 먼저는 rRNA를 사용 제거 키트는 rRNA 뒤 고갈 키트 ( 재료의 표참조)는 거의 완전히 제거 rRNAs 및 총 연속 읽기의 1% 미만 rRNAs에 매핑 되었습니다. 우리 순차적으로 rRNA 고갈 키트에는의 최대 용량 1 μ g은 rRNA 동안 제거 키트의 최대 용량을가지고 있기 때문에이 두 장비를 사용 5 μ g. 우리는 상당한 양의 시퀀싱 읽기 rRNAs에 매핑된 결과 총 RNA의 권장된 금액 보다 더 많은 사용 하는 경험 했다. R-PNK 반응 통해 ATP와 RNAs 라벨 후 rRNA의 성공적인 제거를 확인할 수 있습니다. rRNA 동안 고갈된 RNAs는 50에 해당 하는 지역에 걸쳐 약 150 nt, rRNA 제거 강한 표시 하기 전에 샘플 신호 독특한 밴드 보였다 ~ 300 nt (그림 6).
포 름 알 데히드 가교의 한계가 감소 immunoprecipitation 효율성입니다. 포 름 알 데히드 가교 immunocytochemistry 등의 다른 응용 프로그램에서는 일반적으로 4 %paraformaldehyde 솔루션을 사용 하 여 고정을 위한. 그러나, 그러한 강한 고정 조건이 크게 높은 배경에서 immunoprecipitation 효율성 감소 하기 때문에 fCLIP 실험에 대 한 적용할 수 없습니다. 또한, 포 름 알 데히드 고정 crosslinks 단백질 단백질 복합물 단백질 RNA 복합물 뿐만 아니라. 따라서, 하나는 fCLIP 데이터 해석에 주의 지불 해야 합니다.
이전에 보고 된, mtRNAs intermolecular dsRNAs PKR28에 의해 인식 되는 모양. 우리는 먼저 qRT-PCR을 통해 PKR mtRNA 상호 작용을 검사 하 여 시퀀싱 데이터를 검증. 우리 mtRNAs (그림 7)의 모든 농축 보여주지 않았다 부정적인 컨트롤로 토끼 IgG와 DGCR8 항 체를 사용. 메모의 DGCR8 mtRNAs에서 물리적으로 분리 된 핵 dsRNA 바인딩 단백질으로 사용 되었다. 동시에, PKR 공동 immunoprecipitated RNAs mtRNAs (그림 7)의 강한 농축을 보였다.
더 PKR mtRNA 상호 작용 분석, 우리는 빛 가닥 mtRNAs (그림 8)에서 무거운 물가 mtRNAs를 구별 하 물가 관련 반전 녹음 방송 수행. 우리는 반전 녹음 방송 뇌관 CMV 발기인 순서는 유전자 특정 시퀀스 및 다음 정량 분석에 대 한 왼쪽된 뇌관 및 유전자 특정 오른쪽 뇌관으로 CMV 발기인 시퀀스를 사용 설계. 우리는 또한 테스트 SP6 발기인 CMV 발기인 순서 대신 pGEX 시퀀싱 뇌관 시퀀스. 우리는 CMV 발기인 및 pGEX 뇌관 시퀀스 시퀀싱 보여 좋은 결과 하지 않았다 SP6 발기인 순서를 사용 하 여 발견. 점은 SP6 발기인 순서 (~ 33%)의 낮은 GC 내용 때문 CMV 발기인 (~ 67%)에 비해 그리고 pGEX 시퀀싱 뇌관 (~ 65%) 시퀀스입니다. 물가 관련 반전 녹음 방송에 대 한 제안된 제도 다른 intermolecular dsRNAs에 쉽게 적용할 수 있는 하지만 반전 녹음 방송 뇌관을 디자인할 때 GC 콘텐츠 고려 되어야 합니다.
전반적으로, 우리는 세포 주기 검거 샘플의 준비 및 포름알데히드 가교 및 immunoprecipitation를 통해 상호 작용 하는 PKR RNAs의 농축을 시연 했다. 매우 효율적인 D7F7 항 체를 사용 하 여, 우리 성공적으로 PKR 바인딩된 RNAs를 격리 하 고 생성 하는 높은 처리량 시퀀싱 라이브러리를 분석 하 여 이러한 RNAs를 식별. 또한, PKR에 바인딩된 mtRNAs의 strandedness 분석, 우리는 물가 관련 반전 녹음 방송 접근 제시. 우리 기대 제시 프로토콜 쉽게 다른 dsRBPs의 RNA 인터 intermolecular dsRNAs 감각과 센스 성적 간의 상호 보완 작용을 통해 형성 되는의 strandedness를 공부 하 고 최적화할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 기본적인 과학 연구 프로그램을 통해 국가 연구 재단의 한국 (NRF) 한국 정부 교육부의 과학 및 ICT (NRF-2016R1C1B2009886)에 의해 자금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
| 1 M Tris, pH 7.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1 M Tris, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10% Nonidet-p40 (NP-40) | Biosolution | BN015 | |
| 10X DNA loading buffer | TaKaRa | 9157 | |
| 15 mL conical tube | SPL | 50015 | |
| 3' adaptor | 5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3' | ||
| 3 M Sodium Acetate pH 5.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9740 | |
| 5' adaptor | 5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3' | ||
| 5 M NaCl | Thermo Fisher Scientific | AM9760G | |
| 50 mL conical tube | SPL | 50050 | |
| Acid-phenol chloroform, pH 4.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9722 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads DNA/RNA clean up |
| Antarctic alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0289S | |
| Anti-DGCR8 | Made in house | ||
| Anti-PKR (D7F7) | Cell signaling technology | 12297S | |
| Anti-PKR (Milli) | Millipore EMD | 07-151 | |
| ATP (100 mM) | GE Healthcare | GE27-2056-01 | |
| Bromophenol blue sodium salt | Sigma-aldrich | B5525 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | TaKaRa | 2250A | |
| Cell scraper 25 cm 2-position | Sarstedt | 83.183 | |
| CMV promoter sequence | 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3' | ||
| Dulbecco's modified eagle medium | Welgene | LM001-05 | |
| dNTP mixture (2.5 mM) | TaKaRa | 4030 | |
| Ethanol, Absolute, ACS Grade | Alfa-Aesar | A9951 | |
| Fetal bovine serum | Merck | M-TMS-013-BKR | |
| Formamide | Merck | 104008 | |
| Glycine | Bio-basic | GB0235 | |
| GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | AM9516 | |
| Isopropanol | Merck | 8.18766.1000 | |
| NEBNext rRNA Depletion Kit | New England Biolabs | E6318 | rRNA Depletion Kit |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| Normal rabbit IgG | Cell signaling technology | 2729S | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 6148 | |
| PCR forward primer (RP1) | 5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3' | ||
| PCR index reverse primer (RPI) | 5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3' | ||
| PCR tubes with flat cap, 0.2 mL | Axygen | PCR-02-C | |
| Phosphate bufered saline (PBS) Tablet | TaKaRa | T9181 | |
| Phusion high-fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | High-fidelity polymerase |
| PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotor | Benchmark | c2000 | |
| Polynucleotide kinase (PNK) | TaKaRa | 2021A | |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma-Aldrich | 3115879001 | |
| qPCR primer sequence: CO1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO1 Light | Forward/Reverse: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO2 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO2 Light | Forward/Reverse: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO3 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO3 Light | Forward/Reverse: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CYTB Heavy | Forward/Reverse: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CYTB Light | Forward/Reverse: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: GAPDH | Forward/Reverse: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND1 Light | Forward/Reverse: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND4 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND4 Light | Forward/Reverse: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND5 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND5 Light | Forward/Reverse: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND6 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND6 Light | Forward/Reverse: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Random hexamer | Thermo Fisher Scientific | SO142 | |
| Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/μL) | TaKaRa | 2270A | |
| Recombinant Rnase inhibitor (40 U/μL) | TaKaRa | 2313A | |
| Ribo-Zero rRNA Removal Kit | Illumina | MRZH116 | rRNA Removal Kit |
| Rotator | FINEPCR, ROTATOR AG | D1.5-32 | |
| RT primer sequence: CO1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO2 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO2 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′ | ||
| RT primer sequence: CO3 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO3 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′ | ||
| RT primer sequence: CYTB Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′ | ||
| RT primer sequence: CYTB Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′ | ||
| RT primer sequence: GAPDH | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′ | ||
| RT primer sequence: ND1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND4 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND4 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′ | ||
| RT primer sequence: ND5 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND5 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′ | ||
| RT primer sequence: ND6 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND6 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′ | ||
| Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tube | Bio Plas | 4167SLS50 | |
| Sodium dedecyl sulfate | Biosesang | S1010 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SUPERase In Rnase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | AM2694 | |
| SuperScript III reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18080093 | Reverse transcriptase for library preparation |
| SuperScript IV reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | Reverse transcriptase for qRT-PCR |
| SYBR gold nucleic acid gl stain | Thermo Fisher Scientific | S11494 | |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204 | |
| T4 RNA ligase 2, truncated KQ | New England Biolabs | M0373 | |
| Thermomixer | Eppendorf ThermoMixer C with ThermoTop | ||
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T9250 | |
| Tris-borate-EDTA buffer (TBE) | TaKara | T9122 | |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | |
| Ultralink Protein A sepharose beads | Thermo Fisher Scientific | 22810 | Protein A beads |
| Ultrasonicator | Bioruptor | ||
| Urea | Bio-basic | UB0148 | |
| Vortex mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| γ-32P-ATP (10 μCi/μL, 3.3 μM) | PerkinElmer | BLU502A100UC |
References
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