Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

לומד RNA Interactors של חלבון ה-RNA-מופעל במהלך מחזור התא בתרבית

Published: March 5, 2019 doi: 10.3791/59215
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering and KI for Health Science and Technology (KIHST), Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST)

Summary

אנו מציגים גישות ניסיוניות של RNA-interactors לימוד של זוגיות גדילי RNA מחייב חלבון קינאז מופעל RNA (PKR) במהלך מחזור התא יונקים באמצעות תאים הלה. שיטה זו משתמשת פורמלדהיד קומפלקסים crosslink RNA-PKR, immunoprecipitation להעשיר PKR מכורך RNAs. אלה RNAs ניתן לנתח נוסף דרך רצף תפוקה גבוהה או לרביעיית-PCR.

Abstract

קינאז # פרוטאין קינאז מופעל RNA (PKR) חברה של החלבונים תגובה חיסונית מולדת, מזהה את המבנה משני גדילי כפול של RNAs ויראלי. PKR כאשר הוא מאוגד כדי כפול גדילי ויראלי RNAs (dsRNAs), עובר dimerization ו- autophosphorylation הבאים. PKR phosphorylated (pPKR) הופכת לפעילה ומשרה זירחון של יחידת משנה אלפא של חניכה האיקריוטים פקטור 2 (eIF2α) כדי לדכא את התרגום גלובלית. הגדלת הראיות עולה כי יכול להיות מופעל PKR בתנאים פיזיולוגיים כגון במהלך מחזור התא או בתנאים מתח שונים ללא זיהום. לעומת זאת, ההבנה שלנו של רנ א. תנתק של PKR מוגבל בשל חוסר שיטה ניסיונית מתוקננת לכידת וניתוח dsRNAs אינטראקציה-PKR. כאן, אנו מציגים את ניסיוני פרוטוקול במיוחד להעשיר ולנתח PKR מאוגד RNAs במהלך מחזור התא באמצעות תאים הלה. אנו מנצלים את הפעילות crosslinking יעיל של פורמלדהיד כדי לתקן את מתחמי PKR-RNA ולבודד אותם באמצעות immunoprecipitation. PKR co-immunoprecipitated RNAs ואז יעובד נוספת כדי ליצור ספריה רצף תפוקה גבוהה. אחד כיתת אינטראקציה-PKR dsRNAs הסלולר העיקרי הוא RNAs מיטוכונדריאלי (mtRNAs), אשר יכולה להתקיים בתור dsRNAs הבין-מולקולרי כתהליכי משלימים בין סטרנד-הכבד את RNAs אור-strand. ללמוד את strandedness של אלה mtRNAs דופלקס, אנו מציגים גם עבור סטרנד ספציפיים לרביעיית-PCR פרוטוקול. פרוטוקול שלנו ממוטב עבור הניתוח של RNAs מאוגד-PKR, אך שניתן יהיה לשנותה בקלות ללמוד dsRNAs הסלולר או RNA-interactors של אחרים dsRNA מחייב חלבונים.

Introduction

קינאז # פרוטאין קינאז מופעל RNA (PKR), הידוע גם בשם האיקריוטים חניכה פקטור 2-אלפא קינאז 2 (EIF2AK2), היא קינאז מאופיין היטב ששולחות מידע שסופק על-ידי RNAs. זה שייך האלפא יחידה משנית חניכה 2 תרגום האיקריוטים (eIF2α) המשפחה קינאז, phosphorylates eIF2α-סרין 51 בתגובה לזיהום לדכא את תרגום כללי1. בהקשר זה, PKR מופעל על ידי נגיפי RNAs גדילי כפול (dsRNAs), המספקים פלטפורמה PKR dimerization ו autophosphorylation2. בנוסף eIF2α, PKR יכול phosphorylate גם p53, המצע קולטן לאינסולין 1, מעכב κB וקינאז c-Jun N-מסוף (JNK) להסדיר את הפעילות של רבים האות התמרה חושית מסלולים3,4,5, 6.

PKR זוהה במקור קינאז זה phosphorylated eIF2α במהלך poliovirus זיהום על ידי זיהוי של poliovirus-dsRNAs-7,-8. PKR מצוי יותר ויותר כדי לשחק תפקידים רבת מעבר התגובה החיסונית, aberrant ההפעלה או תקלה שלה היא משתמעת אינספור מחלות אנושיות. PKR מופעל/Phosphorylated (pPKR) נצפית לעתים קרובות במהלך אפופטוזיס, היא מאפיין נפוץ של חולים עם מחלות ניווניות, במיוחד מחלות ניווניות כגון הנטינגטון, פרקינסון של, מחלת אלצהיימר9 ,10,11,12,13. בנוסף, PKR מופעלת בתנאים מתח שונים כגון מתח מטבולית, חום הלם14,15,16,17. מצד שני, עיכוב של PKR התוצאה התפשטות תאים מוגברת שינוי ממאיר אפילו18,19. PKR פונקציה חשובה גם בתפקוד מוח נורמלי, במהלך מחזור התא ככל שרמת pPKR גבוהות במהלך21,2220,שלב M. בהקשר זה, pPKR מעלימה תרגום גלובלית, מספקת רמזים כדי מערכות איתות mitotic מפתח הנדרשים עבור חלוקת התא המתאים20. יתר על כן, הפעלה ממושכת של PKR הביא בשלב G2/M מחזור התא מעצר בתוך השחלה אוגר סיני תאים23. כתוצאה מכך, זרחון PKR מוסדר על ידי הלופ משוב שלילי על מנת להבטיח שחרור משרות מהיר במהלך המעבר M/G121.

למרות הפונקציה טווח רחב של PKR, ההבנה שלנו של PKR ההפעלה מוגבלת בשל חוסר גישה ניסיוני מתוקננת של תפוקה גבוהה כדי ללכוד ולזהות dsRNAs לבצע הפעלה PKR. מחקרים קודמים הראו כי PKR יכול לקיים אינטראקציה עם dsRNAs הנוצרת על-ידי שני הפוך Alu חזרה (IRAlus)20,24, אבל האפשרות לקיומו של dsRNAs הסלולר נוספים לבצע הפעלה PKR במהלך מחזור התא, או תחת תנאי הלחץ בתאי אדם היה שאינו גלוי. הגישה המקובלת לזיהוי RNA-interactors של RNA מחייב חלבון (RBP) משתמש אור UV עד crosslink RNA-RBP מתחמי25,26,27. מחקר שנערך לאחרונה ליישם גישה זו crosslinking UV מערכת עכבר וזיהה RNAs nucleolar קטן יכול לווסת את הפעלת PKR במהלך מתח מטבולית16. על ידי ניצול היעילות crosslinking גבוהה של פורמלדהיד, הצגנו שיטה חלופית לזהות אינטראקציה-PKR RNAs במהלך מחזור התא הלה תאים28. בגישה דומה הוחל ללמוד dsRBPs אחרים כגון Staufen ו Drosha29,30,31. מצאנו כי PKR יכול לקיים אינטראקציה עם סוגים שונים של noncoding RNAs כגון קצר וביניהם גרעיני רכיב (סינוס), רב וביניהם רכיב גרעינית (קו), אלמנט הרטרווירוס אנדוגני (ארב) ו RNAs אפילו אלפא-לוויין. בנוסף, הראינו כי PKR יכול לקיים אינטראקציה עם RNAs מיטוכונדריאלי (mtRNAs), אשר dsRNAs הבין-מולקולרי של טופס דרך משלימים האינטראקציה בין סטרנד-הכבד את האור לנטישה של RNAs28. פרסום האחרונות תמיכה נוספת הנתונים שלנו כי כמה mtRNAs קיים בצורה דו-צדדית, והוא יכול להפעיל dsRNA חיישנים כגון מלנומה בידול-הקשורים חלבון 5 לזירוז האינטרפרונים32. חשוב מכך, הביטוי ואת subcellular לוקליזציה של mtRNAs מאופנן במהלך מחזור התא ועל ידי לחצים שונים, אשר עשוי להיות חשוב על היכולת לווסת את הפעלת PKR28.

במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול מפורט crosslinking פורמלדהיד שפותח לאחרונה, immunoprecipitation (fCLIP) שיטת לכידת וניתוח RNAs אינטראקציה-PKR במהלך מחזור התא. נדגים את השיטה כדי להכין דגימות מעצר מחזור התא באמצעות תימידין ו- nocodazole. לאחר מכן נציג את תהליך fCLIP כדי לבודד RNAs מאוגד-PKR, שיטה להכין ספריית רצף תפוקה גבוהה לזהות אלה RNAs. יתר על כן, אנו ניסחו הליכים מפורטים לנתח RNAs PKR מאוגד באמצעות לרביעיית-PCR. באופן ספציפי, אנו מציגים את הליך שעתוק במהופך סטרנד ספציפיים כדי לנתח את strandedness של mtRNAs. הפרוטוקול המתואר ממוטבת עבור הלה תאים ו- PKR, אך השלבים החשובים כגון הכנת לדוגמה מחזור התא, fCLIP, וניתוח סטרנד ספציפיים לרביעיית-PCR אפשר בקלות לשנות כדי ללמוד dsRNAs הסלולר או כדי לזהות רנ א interactors של אחרים dsRBPs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. פתרון ותא הכנה

  1. פתרון הכנה
    1. עבור המדיום התרבות תאים, היכונו בינוני תרבית תאים הלה על-ידי הוספת 50 מ של סרום שור עוברית (FBS) עד 500 מ"ל בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco).
      הערה: אנטיביוטיקה ניתן להוסיף המדיום התרבות תאים, אך אנחנו לא משתמשים אנטיביוטיקה.
    2. עבור paraformaldehyde 0.1%, להמיס 4% (w/v) paraformaldehyde 1 x Phosphate-Buffered מלוחים (PBS) עם חימום על פלטה חמה ורכים לעשות 30 מ של 0.1% (v/v) paraformaldehyde על-ידי הוספת 1 x PBS.
      התראה: לבצע את כל השלבים בברדס fume, להיזהר לא להרתיח את הפתרון paraformaldehyde. להגן על הפתרון 0.1% מהאור ולאחסן ב 4 º C. השתמש הפתרון תוך חודש.
      הערה: ה-pH של הפתרון הסופי של paraformaldehyde 0.1% (v/v) צריך להיות בסביבות 7.
    3. הכנת מאגר פירוק fCLIP: 20 מ מ טריס-HCl (pH 7.5), 15 מ מ NaCl, 10 מ מ EDTA, 0.5% (v/v) nonidet-p40 (NP-40), 0.1% (v/v) X-100 טריטון, 0.1% (v/v) dodecyl נתרן גופרתי (מרחביות), ו- 0.1% (w/v) נתרן deoxycholate. להוסיף מים מזוקקים טריפל (TDW) 40 מ. חנות ב 4 º C.
    4. הכנת מאגר לשטוף fCLIP: 20 מ מ טריס-HCl (pH 7.5), 150 מ מ NaCl, 10 מ מ EDTA, 0.1% (v/v) NP-40 0.1% (v/v) טריטון X-100, 0.1% (v/v) מרחביות, 0.1% (w/v) נתרן deoxycholate. להוסיף TDW 40 מ. חנות ב 4 º C.
    5. להכין 4 x מאגר PK: 400 מ מ טריס-HCl (pH 7.5), 200 מ"מ NaCl, EDTA 40 מ מ, ו- 4% (v/v) מרחביות. להוסיף TDW 40 מ. לאחסן בטמפרטורת החדר.
    6. הכנת מאגר • תנאי fCLIP: 20 מ של 4 x PK מאגר, g 21 של אוריאה ו- 8.5 מ של TDW. להכין טרי.
    7. הכנת מאגר • תנאי ה-RNA: 0.3 M NaOAc ו- 2% (w/v) מרחביות. לאחסן בטמפרטורת החדר.
    8. להכין 2 x RNA בטעינת צבע: כחול bromophenol 0.025% (w/v), 0.025% (w/v) קסילן cyanol, 5 מ מ EDTA, מרחביות 0.05% (w/v) ו- formamide 95% (v/v). חנות ב-20 ° C.
    9. הכנת מאגר x TBE 1: 0.089 מ' טריס-בוראט ו 0.002 M EDTA. הכנת 500 מ"ל TBE המאגר.
  2. הכנת בבידוד-שלב תאים S או M
    1. ~ 750,000 הזרע או ~ 1,000,000 הלה תאים לדגימות S או M. בבידוד-שלב, בהתאמה. לגדל תאים-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 במשך 24 שעות ביממה.
    2. לטיפול תאי עם תימידין 2 מ מ, תקופת דגירה של 18 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
    3. לשטוף את התאים פעמיים עם PBS. הוסף מדיה טריים, תקופת דגירה של h 9-37 מעלות צלזיוס.
    4. עבור תאים בבידוד-שלב S, יטפל בתאים עם תימידין 2 מ מ. עבור תאים בבידוד-שלב M, יטפל בתאים עם 100 ננוגרם למ"ל nocodazole. תקופת דגירה של h 15 תאים 37 ° C וקציר.
      הערה: אחידות הדגימות מחזור התא ניתן לבדוק באמצעות FACS.

2. פורמלדהיד cross-linking, immunoprecipitation

  1. תא קציר
    1. עבור דוגמה שלב S, איסוף תאים עם תא במגרדת, העברת לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. עבור דוגמה שלב M, הקש על הצד של המנה תרבות תא ניתוק התאים בבידוד-שלב M ולהעביר אותם לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל.
      הערה: כדי להגדיל את ההומוגניות של התאים בבידוד-שלב M, אין להשתמש במגרדת תא.
    2. Centrifuge התאים ב 380 x גרם בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות להסיר את תגובת שיקוע והשהה מחדש עם 1 מ"ל של PBS קר והעברת לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL.
    3. Centrifuge התאים ב 10,000 x g ב 4 ° C עבור הסרה ס' 30 את תגובת שיקוע לחלוטין.
  2. Crosslinking פורמלדהיד
    1. הוסף μL 750 של 0.1% paraformaldehyde 10 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לתקן את התאים.
    2. להוסיף 250 μL של 1 מ' גליצין, דגירה נוסף של 10 דקות בטמפרטורת החדר, כדי להרוות את התגובה. Centrifuge התאים ב 10,000 x g ב 4 ° C עבור הסרה ס' 30 את תגובת שיקוע לחלוטין.
    3. להשעות מחדש עם 1 מ"ל ל- PBS. Centrifuge התאים ב 10,000 x g ב- 4 ° C עבור 30 s והסר תגובת שיקוע.
    4. להשעות מחדש עם 400 μL fCLIP פירוק מאגר עם מעכב פרוטאז 0.2% (v/v) ו- 2% (v/v) RNase מעכב. דגירה על קרח למשך 10 דקות, sonicate משתמש של ultrasonicator.
    5. הוסף μL 11 של 5 M NaCl להתאמת NaCl ריכוז ~ 150 מ"מ. מערבולת בקצרה, צנטריפוגה ב 21,130 x g ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות להעביר את תגובת שיקוע צינור microcentrifuge mL 1.5 מראש צוננת.
      הערה: שומרים על μL 40 של תגובת שיקוע בשפופרת צנטרפוגה חדשים כמו הדוגמה קלט. חנות המדגם קלט ב 4 º C.
  3. Immunoprecipitation
    1. הוסף 20 μL של חלבון A חרוזים לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL.
    2. לשטוף את החרוזים עם 400 μL fCLIP פירוק המאגר. Centrifuge החרוזים ב 1,000 x g ב 4 ° C עבור דק 1. הסר את תגובת שיקוע והוסף μL 400 fCLIP פירוק מאגר בקפידה. בעדינות מחדש להשעות את החרוזים על-ידי היפוך 3 ~ 4 פעמים.
    3. חזור על השלב שטיפת שלוש פעמים. לאחר השטיפה הסופית להסיר לחלוטין את תגובת שיקוע.
    4. מחדש להשעות את החרוזים ב- 300 μL fCLIP פירוק המאגר. הוסף μL 8.3 של 5 M NaCl להתאמת NaCl ריכוז ~ 150 מ"מ. להוסיף 10 μL של PKR נוגדן ולאחר תקופת דגירה של h 3 ב מסובב ב 4 º C.
    5. Centrifuge החרוזים ב 1,000 x g ב 4 ° C עבור דק 1. הסר את תגובת שיקוע והוסף μL 400 fCLIP שטיפת המאגר. בעדינות מחדש להשעות את החרוזים על-ידי היפוך 3 ~ 4 פעמים.
    6. חזור על השלב לשטוף פעמיים. לאחר השטיפה הסופית להסיר לחלוטין את תגובת שיקוע.
      הערה: אף פעם לא השתמש מערבל מערבולת. היפוך הצינור בעדינות בידיים.
    7. להוסיף 300 μL של lysate, תקופת דגירה של h 3-4 מעלות צלזיוס על מסובב.
      הערה: זמן דגירה יותר עלולה לגרום באיגוד רקע מוגבר.
    8. Centrifuge החרוזים ב 1,000 x g ב 4 ° C עבור דק 1. הסר את תגובת שיקוע והוסף μL 400 fCLIP שטיפת המאגר. בעדינות מחדש להשעות את החרוזים על-ידי היפוך 3 ~ 4 פעמים.
    9. חזור על השלב שטיפת שלוש פעמים. לאחר השטיפה הסופית להסיר לחלוטין את תגובת שיקוע.
    10. להוסיף 300 μL fCLIP • תנאי המאגר. דגירה ב thermomixer עבור 3 h ב- 25 ° C עד elute PKR של החרוזים.
      הערה: להכין fCLIP • תנאי מאגר הטרייה.
    11. צנטריפוגה ב x 1000 g בטמפרטורת החדר, להעביר את תגובת שיקוע siliconized צינור נקי.
      הערה: צינור microcentrifuge זה גם בסדר, אבל צינור siliconized מועדף כדי למנוע התאיידות במהלך השלב דה-crosslinking (שלב 2.3.12).
    12. להוסיף 300 μL של proteinase K (20 מ"ג/מ"ל), דגירה בין לילה-65 מעלות צלזיוס.
      הערה: השתמש thermomixer עם מכסה מחומם כדי למנוע התאיידות.
  4. החילוץ-RNA
    1. להוסיף μL 580 של חומצה-פנול כלורופורם, מערבולת של Incubate ס' 30-37 מעלות לשעה.
    2. מערבולת עבור 30 s ו צנטריפוגה ב x 12,000 g בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
    3. להעביר את השכבה העליונה לתוך צינור נקי mL 1.5 microcentrifuge. הוסף 1/10 נפח של 3 מ' NaOAc, 0.5 μL של coprecipitant (למשל, Glycoblue), ואמצעי אחסון שווה של אלכוהול איזופרופיל. דגירה בין לילה ב-20 ° C.
    4. לזרז כדורי מאת צריך שתוציאו במהירות המרבית ב 4 ° C עבור 1 h.
      הערה: אם לא נצפו RNA/DNA כדורי, להוסיף μL 0.5 נוספים של coprecipitant, צנטריפוגה עבור נוספים 1 ח' המשך שלב זה עד כדורי RNA/DNA הם נצפו.
    5. הסר את תגובת שיקוע והוסף 1 מ"ל של 75% אתיל אלכוהול. צנטריפוגה ב x 12,000 g ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. חזור על השלב לשטוף עוד פעם אחת. להסיר לחלוטין את תגובת שיקוע ויבש בגדר בטמפרטורת החדר.
    6. להוסיף μL 42 של TDW, 5 μL של DNase אני מאגר, μL 1 של מעכב RNase 2 μL של דגירה אני DNase 37 מעלות לשעה.
    7. להוסיף 150 μL של TDW וμl 200 של חומצה-פנול כלורופורם. מערבולת עבור צנטריפוגה ס' 30 ב x 12,000 g בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
    8. להעביר את השכבה העליונה לתוך צינור נקי mL 1.5 microcentrifuge. הוסף 20 μL של 3 מ' NaOAc, 0.5 μL של coprecipitant, ו- 1 מ"ל של 100% אתיל אלכוהול. דגירה בין לילה ב- 80 ° c
    9. לזרז כדורי ולשטוף עם 75% אתיל אלכוהול כמתואר בצעדים 2.4.4 כדי 2.4.5.
    10. מחדש להשעות, הכמות המתאימה של TDW.

3. רצף ספריית הכנה

  1. הסרת rRNA
    1. מחדש להשעות את כדורי ה-RNA מהשלב 2.4.10 עם 28 μL של TDW.
      הערה: הכמות המרבית של RNA הכולל צריך להיות פחות מ- 5 μg.
    2. בצע את ההליכים הניתנים על ידי המדריך של הערכה rRNA להסרת להסרת rRNA.
    3. לנקות rRNA דלה RNAs על-ידי הוספת μL 160 של beads מגנטי.
      1. לערבב על-ידי pipetting ~ 15 פעמים, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
      2. לצרף את הצינורית על פס מגנטי ולהסיר את תגובת שיקוע.
      3. להוסיף 300 μL של 80% אתיל אלכוהול בזמן החרוזים עדיין מחוברים על הבר מגנטי תקופת דגירה של 30 s.
      4. החלף אתיל אלכוהול פתרון 300 μL טריים. האוויר יבש את החרוזים על הבר מגנטי עבור 12 דקות בטמפרטורת החדר.
      5. מחדש להשעות את החרוזים ב 12 μL של TDW, מיקס על ידי pipetting 15 פעמים.
      6. לצרף את החרוזים על הבר מגנטי והזז את תגובת שיקוע צינור נקי PCR.
    4. לרוקן את RNAs ribosomal מפוצלים (rRNAs) בעקבות ההליכים הניתנים על ידי rRNA דלדול קיט.
    5. לנקות את RNAs על-ידי הוספת μL 110 של beads מגנטי של צעדים חוזרת 3.1.3.1 כדי 3.1.3.6.
  2. מצדו תיוג, מתאם ה-RNA
    1. RNAs מדולדל rRNA, להוסיף 2 μL 10 מאגר x CIAP, μL 1 של מעכב RNase 2 μL של phosphatase אלקליין האנטארקטי. דגירה 37 ° C עבור 1 h ולאחר מכן 65 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות כדי להשבית את פוספטאז.
    2. להוסיף 3 μL 10 מאגר x PNK, μL 1.5 של RNase מעכב, μL 1.5 של אנזים T4 PNK, μL 0.8 של r-ATP ו 1.7 μL של TDW. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 50 דקות.
    3. להוסיף 1.5 μL 10 מ מ ATP, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות נוספות.
    4. לעצור את התגובה על ידי הוספת μL 170 המאגר • תנאי ה-RNA.
    5. להוסיף 200 μL של חומצה-פנול כלורופורם, מערבולת של צנטריפוגה ס' 30 ב x 12,000 g בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
    6. להעביר את השכבה העליונה לתוך צינור נקי mL 1.5 microcentrifuge. הוסף 20 μL של 3 מ' NaOAc, 0.5 μL של coprecipitant, ו- 1 מ"ל של 100% אתיל אלכוהול. דגירה בין לילה ב- 80 ° c
    7. לזרז את כדורי ה-RNA, לשטוף עם 75% אתיל אלכוהול כמתואר בצעדים 2.4.4 כדי 2.4.5. להשעות מחדש ב- 4.5 μL של TDW ולהוסיף μL 9 של 2 x צבע טעינת ה-RNA.
    8. מחממים את המדגם ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות, העומס על ג'ל אוריאה-דף 10%.
    9. הפעל את הג'ל-370 V למשך 40 דקות.
      הערה: הפעל מראש את הג'ל על 370 V במשך 90 דקות לפני שיטען הדוגמה.
    10. לחתוך את הג'ל על האזור נוקלאוטיד ~ 100 – 500 ו לשבור את הג'ל.
    11. להוסיף 700 μL של 0.3 M NaCl, דגירה בין לילה ב 4 ° C-מסובב.
    12. להעביר את הפתרון העמודה ואת צנטריפוגה-מהירות מירבית בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
    13. להעביר את eluate לתוך צינור נקי mL 1.5 microcentrifuge. הוסף 1/10 נפח של 3 מ' NaOAc, 0.5 μL של coprecipitant, ואמצעי אחסון שווה של אלכוהול איזופרופיל. דגירה בין לילה ב-20 ° C.
  3. מתאם מצדו 3'
    1. לזרז את כדורי ה-RNA, לשטוף עם 75% אתיל אלכוהול כמתואר בצעדים 2.4.4 כדי 2.4.5.
    2. מחדש להשעות את כדורי ה-RNA ב- 6.5 μL של TDW ולהוסיף 1 μL של μM 10 3' מתאם.
    3. הפתרון להעביר צינור PCR, דגירה-70 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
    4. להוסיף 1 μL מאגר מצדו של 10 x 0.5 μL של מעכב RNase, μL 1 של T4 RNA ליגאז 2. דגירה ב 28 ° C עבור h 1, 25 מעלות במשך 6 שעות, 22 מעלות במשך 6 שעות.
    5. הוסף μL 12 של 2 x RNA בטעינת צבע וחום ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
    6. ג'ל לטהר את 3' מתאם מאתרים RNAs כפי שמתואר 3.2.9 כדי 3.2.13.
  4. 5' מתאם מצדו
    1. לזרז את כדורי ה-RNA, לשטוף עם 75% אתיל אלכוהול כמתואר בצעדים 2.4.4 כדי 2.4.5.
    2. מחדש להשעות את כדורי ה-RNA ב- 4.2 μL של TDW ולהוסיף 1 μL של μM 5 5' מתאם.
    3. הפתרון להעביר צינור PCR, דגירה-70 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
    4. הוסף μL 0.8 x 10 ליגאז מאגר, μL 0.4 של RNase מעכב, 0.8 μL 10 מ מ ATP, μL 0.8 של T4 RNA ליגאז 1. דגירה ב 28 ° C עבור h 1, 25 מעלות במשך 6 שעות, 22 מעלות במשך 6 שעות.
  5. שעתוק במהופך ו- PCR-הגברה
    1. 5' מתאם RNAs מחוברים, להוסיף 1 μL של 4 μM שעתוק במהופך פריימר. דגירה-70 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ו מיד להצטנן עד 4 ° C.
    2. להוסיף 4 μL מאגר FS x 5, μL 4 של 2.5 מ מ dNTP, μL 1 של 0.1 M DTT, μL 1 של מעכב RNase μL 1 של רוורס טרנסקריפטאז. דגירה ב 50 ° C 1 h, 70 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    3. להכין PCR-הגברה
      1. לערבב 1 μL של המוצר RT, μL 1 של פריימר RPI μM 25, 1 μL של פריימר RP1 μM 25, 10 μL של 5 x HF מאגר, μL 4 של 2.5 מ מ dNTP, 32.5 μL של TDW ו 0.5 μL של פולימראז אמינות גבוהה.
      2. הפעל תוכנית ה-PCR 11 ~ 13 מחזורים.
        הערה: התוכנית עבור ה-PCR הוא: 98 ° C ל 30 s בתור התחלה חם, 98 ° C עבור 10 s, 60 ° C ל 30 s ו- 72 מעלות צלזיוס במשך 45 s עבור הגברה, ו- 72 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. הצעד הגברה חוזרת 11-13 מחזורים.
    4. לנקות את המוצרים PCR באמצעות μL 40 של beads מגנטי, השלבים הבאים 3.1.3.1 כדי 3.1.3.6 אבל בעזרת 10 μL של TDW elute ה-DNA.
    5. להוסיף 2 μL של צבע ההעמסה של ה-DNA x 10. טען את הדגימה על ג'ל אקרילאמיד 6% והשתמש ב- 200 וולט למשך 30 דקות.
    6. כתם עם Sybr זהב (0.01% (v/v) במאגר x TBE 1) למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    7. מבטל את כתם במאגר x TBE 1 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    8. לחתוך את הג'ל על האזור נוקלאוטיד ~ 200-700 ו לשבור את הג'ל.
    9. להוסיף 700 μL של 0.3 M NaCl, דגירה ללילה בטמפרטורת החדר כדי elute את ה-DNA.
    10. להעמיס את הכל על עמודה בעלת צנטריפוגה-מהירות מירבית בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
    11. להעביר את eluate לתוך צינור נקי mL 1.5 microcentrifuge. הוסף 1/10 נפח של 3 מ' NaOAc, 0.5 μL של coprecipitant, ואמצעי אחסון שווה של אלכוהול איזופרופיל. דגירה בין לילה ב-20 ° C.
    12. לזרז את כדורי ה-DNA, לשטוף עם 75% אתיל אלכוהול כמתואר בצעדים 2.4.4 כדי 2.4.5. להשעות מחדש ב 20 μL של TDW.
    13. לנתח את הדגימה תוך שימוש ברצף.

4. ניתוח של אינטראקציה-PKR RNAs באמצעות לרביעיית-PCR

  1. שיטה 1: hexamer אקראיים שעתוק במהופך
    1. מחדש להשעות את כדורי ה-RNA מהשלב 2.4.10 עם 8.5 μL של TDW ולהעביר את הפתרון צינור ה-PCR.
    2. להוסיף 0.5 μL של 100 μM אקראי hexamers וμl 4 של מיקס dNTP 2.5 מ מ.
    3. חום הפתרון ב 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ומיד תדגור על קרח לפחות 1 דקות
    4. גורמות לתגובה לערבב: μL 4 5 מאגר x SSIV, 1 μL של 100 מ מ DTT, μL 1 של מעכב RNase ולאחר μL 1 של רוורס טרנסקריפטאז (200 U μL). להוסיף את תערובת התגובה הפתרון RNA.
    5. דגירה התערובת ב 23 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 50 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ו- 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    6. לנתח את cDNA באמצעות מערכת ה-PCR בזמן אמת.
      הערה: התוכנית עבור ה-PCR בזמן אמת זה: 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות בשביל התחלה לוהטת, 95 ° C 5 s ו- 60 מעלות צלזיוס במשך 10 s עבור הגברה, ו 95 ° C ל 30 s, 65 ° C ל 30 s, ו 95 ° C ל 30 s עבור להמיס. הצעד הגברה הוא חזר 40 מחזורים.
  2. שיטה 2: ספציפי סטרנד שעתוק במהופך
    1. להכין תערובת הבסיס של תחל הפוכה: מערבבים כמויות שוות של גנים ספציפיים שעתוק במהופך תחל המכיל רצף יזם CMV ואחריו ~ 20 נוקלאוטידים של ג'ין רצפים ספציפיים.
      הערה: הריכוז משולב של כל גן ספציפי RT תחל זה 4 μM.
    2. מחדש להשעות את כדורי ה-RNA מהשלב 2.4.10 עם 8.5 μL של TDW ולהעביר את הפתרון צינור ה-PCR.
    3. להוסיף 0.5 μL של 4 מיקס מאסטר μM של שעתוק במהופך תחל ו 4 μL של מיקס dNTP 2.5 מ מ.
    4. חום הפתרון ב 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ומיד תדגור על קרח לפחות 1 דקות
    5. הכן את הפתרון התגובה על ידי ערבוב μL 4 5 מאגר x SSIV, 1 μL של 100 מ מ DTT, μL 1 של מעכב RNase ולאחר μL 1 של רוורס טרנסקריפטאז (200 U μL). הוסף את הפתרון התגובה לתערובת RNA-פריימר.
    6. דגירה הפתרון ב 50 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ו- 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    7. לנתח את cDNA באמצעות מערכת ה-PCR בזמן אמת.
      הערה: התוכנית עבור ה-PCR בזמן אמת זה בדיוק כמו זה שמתואר בשיטה 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מפרטים טכניים עבור התהליך לעצור הלה תאים בשלב S או M של מחזור התא מוצג באיור1. עבור דוגמה מ' בבידוד-שלב, שאנו יכולים לדמיין בבירור עגול בצורת התאים במיקרוסקופ (איור 2 א). לבחון את היעילות של המעצר מחזור התא, התוכן הגרעיני של התא יכול להיות מנותח באמצעות FACS (איור 2B). איור 3 מראה נציג נתונים לבדיקת יעילות immunoprecipitation, שבו הנוגדן D7F7 מראה יכולת מעולה כדי immunoprecipitate PKR. אולי ההבדל הזה היעילות immunoprecipitation לידי ביטוי הפער בחלוקת מחלקה של ספריות רצף תפוקה גבוהה המוכנים שני נוגדנים PKR שונים (איור 4). ייחודה של הנוגדן D7F7 עוד יותר אושר באמצעות ניתוח המערבי כל כתם של PKR immunoprecipitate (איור 5A) והתא סך lysate (איור 5B). איור 6 מציגה את האות radioisotope לפני ואחרי הסרת rRNAs במהלך הכנת ספריה רצף תפוקה גבוהה. איור 7 מציג את העשרת של mtRNAs RNAs co-immunoprecipitated עם PKR, אך לא RNAs co-immunoprecipitated עם הארנב IgG או תיסמונת תסמונת כרומוזומלית לאזור 8 (DGCR8). איור 8 מראה סטרנד נציג ספציפי לרביעיית-PCR ניתוח של PKR מכורך mtRNAs S או M-פאזי נעצר דגימות.

Figure 1
איור 1: סכימטי על הדגימות מעצר הכנה מחזור התא. (A, B) רישומי ההכנה של S (A) או תאים הלה בבידוד-שלב M (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: ניתוח של מחזור התא נעצר דגימות. (א) שלב תמונות בניגודיות בבידוד-שלב דגימות S או M. ברים עולה 250 μm. ניתוח (B) FACS מציג את התוכן הגרעיני של הדגימות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: Immunoprecipitation יעילות בדיקת נוגדנים PKR. העשרה מוצלחת של RNAs מאוגד-PKR, נוגדן יעילות immunoprecipitation סופית כמו הנוגדן D7F7 אמור לשמש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: RNA שיעור חלוקת רצף ספריות שהוכנו באמצעות נוגדנים PKR שונה. באמצעות נוגדנים PKR שונים עבור fCLIP הביא התפלגות דרגות שונות הקריאות רצף ממופה. הפער סביר עקב הבדלים יעילות immunoprecipitation. איור זה השתנה מ קים et al.28. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: ייחודה של הנוגדן D7F7 PKR. (A, B) חשופה כל ניתוח המערבי של PKR immunoprecipitated (א) או הכולל הלה lysate (B) הראה רק אחד הלהקה חזקים המתאימים לגודל של PKR, המציינת כי D7F7 נוגדן ספציפי מאוד בזיהוי PKR. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: Radioisotope סיגנל PKR co-immunoprecipitated RNAs. (א) PKR co-immunoprecipitated RNAs יכול יזוהו על-ידי תיוג 5' הקצוות שלהם עם r-ATP. (B) הדירי radioistope אות נצפתה על הסרה מוצלחת של rRNA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: אימות של אינטראקציות PKR-mtRNA. הרשמו2 העשרה קיפול של mtRNAs RNAs co-immunoprecipitated עם נוגדנים המצוין. רק PKR co-immunoprecipitated RNA המדגם הראה העשרה חזק של mtRNAs. נוגדנים IgG ארנב, DGCR8 שימשו כפקדי שלילי. איור זה השתנה מ קים et al.28. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 8
איור 8: ניתוח לרביעיית-PCR סטרנד ספציפיים של PKR מכורך mtRNAs. (A, B) שעתוק במהופך סטרנד ספציפיים שימש כדי לנתח את strandedness של mtRNAs שהיו co-immunoprecipitated עם PKR S (A) או תאים בבידוד-שלב M (B). איור זה השתנה מ קים et al.28. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

באיור1 מודגם התהליך להכין בבידוד-שלב דגימות S או M. לעצור תאים בשלב S, השתמשנו שיטה בלוק זוגי תימידין שבו התייחסנו תאים עם תימידין פעמיים עם שחרורו 9 h בין כדי להבטיח יעילות גבוהה מעצר (איור 1 א'). מעצר שלב M, התייחסנו תאים פעם אחת עם תימידין ולאחריו שחרור 9 h, ואז נמרח nocodazole בלוק תאי-prometaphase (איור 1B). צעד המפתח של הכנת המדגם מחזור התא הוא הצעד שחרור לאחר הרחוב הראשון של תימידין. כדי להסיר לחלוטין תימידין, חיוני לשטוף את התאים לפחות שתי פעמים עם PBS טריים. כביסה לא תקין של תימידין שיורית יכול לגרום הטרוגניות מוגברת, ירידה תא הכדאיות. ההצלחה של M שלב מעצר יכול להיות אישרו באופן חזותי המבוסס על הגדלת מספר התאים בצורת עגול (איור 2 א). עם זאת, הדוגמה שלב M עדיין מכיל תאים לאטמוספרה רבים בהתבסס על המורפולוגיה שלהם. כדי לאסוף רק שלב M נעצר תאים, והגשנו בקשה בכוח פיזי כדי לנתק M שלב תאים מפני השטח. התוכן גרעיני התאים שנקטפו נבדק עוד יותר באמצעות FACS, אשר הראו לשיא רחבה בין 2n 4n שלב S ו לשיא חד-4n עבור M בבידוד-שלב הדגימה (איור 2B). פרוטוקול הציג ממוטב הלה תאים, אשר יש זמן הכפלה של 24 שעות. ניתן ליישם את הרעיון של בלוק תימידין של תימידין-nocodazole זוגי שורות תאים אחרים, אבל המשכים טיפול ושחרור של סמים המדויק צריך להיות מותאם בהתבסס על זמן ההכפלה של תאי היעד.

כדי לזהות אינטראקציה-PKR RNAs, אנחנו מתחמי תפור PKR-RNA עם פורמלין והפרו את בהם דרך immunoprecipitation. גורם מפתח הקובע את הדיוק של הניתוח שלאחר מכן הוא היעילות של immunoprecipitation. בדקנו נוגדנים רבים המספקים לקהלי היעד epitopes שונים של החלבון PKR על מנת לקבוע את הנוגדן להכנת ספריית רצף תפוקה גבוהה. כפי שמוצג באיור3, מצאנו את זה הנוגדן D7F7 מזהה האזור מקשר בין התחומים איגוד dsRNA לבין קבוצת המחשבים קטליטי הראו יכולת מעולה לכידת PKR. הנוגדן השני שמוצג באיור 3 (מילי) מזהה האזור N-מסוף, אך מציג יכולת מסכן של immunoprecipitating PKR. כתוצאה מכך, הספרייה רצף תפוקה גבוהה המוכנים הנוגדן מילי הכיל הרבה קריאות רצף רקע הפזורים הגנום, במיוחד ב אינטרונים, בלי הצטברויות שונות על אזורים ספציפיים28 (איור 4). אנו מאמינים שהסתירות בספריות רצף שני הם בעיקר עקב ההבדלים ביכולות של הנוגדנים בלכידת PKR במהלך השלב immunoprecipitation. בהמשך נבחנו יחודיות של הנוגדן D7F7 PKR דרך כל כתם ניתוחים המערבי של immunoprecipitate (איור 5A), הלה הכולל lysates (איור 5B). ב שני שהכלים, הבחנו רק אחד הלהקה חזק המתאים PKR. אפשרות זו מציינת כי הנוגדן D7F7 היא מאוד ספציפית, כי הנתונים רצף שהושג באמצעות הנוגדן D7F7 סביר מבטאות אמת interactors RNA של PKR.

שלב קריטי במהלך הכנת ספריה רצף תפוקה גבוהה היא הסרת rRNAs. מאז אנו תפור מתחמי RNA-RBP עם פורמלין, השתמשנו של ultrasonicator עבור פירוק מוחלט של התאים. תהליך זה הביא לפיצול של rRNAs, אשר הקטינה באופן משמעותי את היעילות של rRNA הסרה באמצעות rRNA את הסרת ערכת. כדי לפתור בעיה זו, השתמשנו לראשונה את rRNA הסרת ערכת ואחריו rRNA דלדול קיט (ראה טבלה של חומרים), אילו הוסרו כמעט לחלוטין rRNAs, פחות מ 1% של קריאות הכולל רצף מופו rRNAs. השתמשנו ערכות אלה שני ברצף כי rRNA דלדול ערכת יש קיבולת מקסימלית של רק 1 μg תוך rRNA הסרת ערכת יש קיבולת מקסימלית של 5 μg. אנחנו חוו משתמש יותר מאשר הכמות המומלצת של RNA הכולל התוצאה היא כמות משמעותית של רצף פעולות הקריאה ממופים ל- rRNAs. הסרת מוצלח של rRNA יכול לאשר לאחר תיוג של RNAs עם r-ATP דרך התגובה PNK. בזמן rRNA RNAs מדולדל הראה להקה ברורים בסביבות 150 nt, המדגם לפני הסרת rRNA מראה חזק אות בכל רחבי האזור המקביל ה-50 ~ 300 nt (איור 6).

מגבלה אחת של פורמלדהיד crosslinking היא ירידה immunoprecipitation יעילות. יישומים אחרים של פורמלדהיד crosslinking כגון immunocytochemistry משתמשים בדרך כלל 4% paraformaldehyde פתרון עבור קיבעון. עם זאת, תנאי קיבוע חזק כזה אין אפשרות להחיל לניסוי fCLIP כי זה מקטין באופן משמעותי את יעילות immunoprecipitation, דבר המתבטא רקע גבוה יותר. יתר על כן, פורמלדהיד קיבוע crosslinks חלבון מתחמי בנוסף מתחמי חלבון-RNA. לכן, צריך לשלם זהירות לפרש את הנתונים fCLIP.

כפי שדווח בעבר, mtRNAs בצורת dsRNAs הבין-מולקולרי המזוהים על-ידי PKR28. אנחנו קודם לאמת נתונים רצף שלנו על-ידי בדיקת אינטראקציות PKR-mtRNA דרך לרביעיית-PCR. השתמשנו ארנב איג, DGCR8 נוגדנים כפקדי שליליים, אשר לא הראה כל העשרה של mtRNAs (איור 7). ראוי לציין, DGCR8 שימש פרוטאין מחייב dsRNA הגרעינית אשר מופרד פיזית מפני mtRNAs. במקביל, PKR co-immunoprecipitated RNAs הראה העשרה חזק של mtRNAs (איור 7).

בהמשך לניתוח אינטראקציות PKR-mtRNA, ביצענו שעתוק במהופך סטרנד ספציפיים כדי להבדיל את mtRNAs כבד-strand לבין mtRNAs אור-סטרנד (איור 8). תיכננו שעתוק במהופך תחל שיש רצף יזם CMV ולאחריו רצף גנים ספציפיים, לאחר מכן להשתמש רצף יזם CMV פריימר השמאלי, תחל נכון גנים ספציפיים עבור הניתוח qPCR. בדקנו גם יזם SP6 ורצפים pGEX רצף פריימר במקום רצף יזם CMV. מצאנו כי בעוד יזם CMV ו pGEX רצף פריימר רצפים הראו תוצאות טובות, באמצעות הרצף יזם SP6 לא. ההבדל נובע התוכן GC נמוכה של הרצף יזם SP6 (כ-33%) בהשוואה לאלו של האמרגן CMV (~ 67%) pGEX רצף פריימר (~ 65%) רצפים. התכנית המוצעת עבור שעתוק במהופך סטרנד ספציפי ניתן בקלות ליישם אחרים dsRNAs הבין-מולקולרי, אך בעת עיצוב של תחל שעתוק במהופך, התוכן GC צריך להילקח בחשבון.

בסך הכל, להדגים את הכנת דוגמאות מחזור התא נעצר והעשרה של אינטראקציה-PKR RNAs דרך crosslinking פורמלדהיד, immunoprecipitation. באמצעות נוגדנים יעילים ביותר D7F7, יש לנו בהצלחה מבודד PKR מכורך RNAs ואנו המזוהה RNAs אלה על-ידי יצירת וניתוח ספרייה רצף תפוקה גבוהה. יתר על כן, כדי לנתח את strandedness של mtRNAs קשורה PKR, הצגנו בגישה שעתוק במהופך סטרנד ספציפיים. אנו מצפים כי ניתן למטב בקלות פרוטוקול הציג ללמוד RNA interactors של אחרים dsRBPs ו strandedness של dsRNAs הבין-מולקולרי שנוצרו באמצעות משלימים האינטראקציה בין חוש antisense תעתיקים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על-ידי תוכנית מחקר מדעי בסיסי דרך לאומי מחקר קרן של קוריאה (ב- NRF) ממומן על ידי ממשלת קוריאה משרד המדע ICT (ה-NRF-2016R1C1B2009886).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific AM9260G
1 M Tris, pH 7.0 Thermo Fisher Scientific AM9855G
1 M Tris, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific AM9855G
1.7 mL microcentrifuge tube Axygen MCT-175-C
10% Nonidet-p40 (NP-40) Biosolution BN015
10X DNA loading buffer TaKaRa 9157
15 mL conical tube SPL 50015
3' adaptor 5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3'
3 M Sodium Acetate pH 5.5 Thermo Fisher Scientific AM9740
5' adaptor 5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3'
5 M NaCl Thermo Fisher Scientific AM9760G
50 mL conical tube SPL 50050
Acid-phenol chloroform, pH 4.5 Thermo Fisher Scientific AM9722
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63881 Magnetic beads DNA/RNA clean up
Antarctic alkaline phosphatase New England Biolabs M0289S
Anti-DGCR8 Made in house
Anti-PKR (D7F7) Cell signaling technology 12297S
Anti-PKR (Milli) Millipore EMD 07-151
ATP (100 mM) GE Healthcare GE27-2056-01
Bromophenol blue sodium salt Sigma-aldrich B5525
Calf intestinal alkaline phosphatase TaKaRa 2250A
Cell scraper 25 cm 2-position Sarstedt 83.183
CMV promoter sequence 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'
Dulbecco's modified eagle medium Welgene LM001-05
dNTP mixture (2.5 mM) TaKaRa 4030
Ethanol, Absolute, ACS Grade Alfa-Aesar A9951
Fetal bovine serum Merck M-TMS-013-BKR
Formamide Merck 104008
Glycine Bio-basic GB0235
GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL) Thermo Fisher Scientific AM9516
Isopropanol Merck 8.18766.1000
NEBNext rRNA Depletion Kit New England Biolabs E6318 rRNA Depletion Kit
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404
Normal rabbit IgG Cell signaling technology 2729S
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 6148
PCR forward primer (RP1) 5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3'
PCR index reverse primer (RPI) 5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3'
PCR tubes with flat cap, 0.2 mL Axygen PCR-02-C
Phosphate bufered saline (PBS) Tablet TaKaRa T9181
Phusion high-fidelity DNA polymerase New England Biolabs M0530 High-fidelity polymerase
PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotor Benchmark c2000
Polynucleotide kinase (PNK) TaKaRa 2021A
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Sigma-Aldrich 3115879001
qPCR primer sequence: CO1 Heavy Forward/Reverse: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO1 Light Forward/Reverse: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO2 Heavy Forward/Reverse: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO2 Light Forward/Reverse: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO3 Heavy Forward/Reverse: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO3 Light Forward/Reverse: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CYTB Heavy Forward/Reverse: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CYTB Light Forward/Reverse: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: GAPDH Forward/Reverse: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND1 Heavy Forward/Reverse: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND1 Light Forward/Reverse: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND4 Heavy Forward/Reverse: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND4 Light Forward/Reverse: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND5 Heavy Forward/Reverse: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND5 Light Forward/Reverse: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND6 Heavy Forward/Reverse: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND6 Light Forward/Reverse: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Random hexamer Thermo Fisher Scientific SO142
Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/μL) TaKaRa 2270A
Recombinant Rnase inhibitor (40 U/μL) TaKaRa 2313A
Ribo-Zero rRNA Removal Kit Illumina MRZH116 rRNA Removal Kit
Rotator FINEPCR, ROTATOR AG D1.5-32
RT primer sequence: CO1 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′
RT primer sequence: CO1 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′
RT primer sequence: CO2 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′
RT primer sequence: CO2 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′
RT primer sequence: CO3 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′
RT primer sequence: CO3 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′
RT primer sequence: CYTB Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′
RT primer sequence: CYTB Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′
RT primer sequence: GAPDH 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′
RT primer sequence: ND1 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′
RT primer sequence: ND1 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′
RT primer sequence: ND4 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′
RT primer sequence: ND4 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′
RT primer sequence: ND5 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3′
RT primer sequence: ND5 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′
RT primer sequence: ND6 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′
RT primer sequence: ND6 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′
Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tube Bio Plas 4167SLS50
Sodium dedecyl sulfate Biosesang S1010
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750
SUPERase In Rnase inhibitor Thermo Fisher Scientific AM2694
SuperScript III reverse transcriptase Thermo Fisher Scientific 18080093 Reverse transcriptase for library preparation
SuperScript IV reverse transcriptase Thermo Fisher Scientific 18090010 Reverse transcriptase for qRT-PCR
SYBR gold nucleic acid gl stain Thermo Fisher Scientific S11494
T4 polynucleotide kinase New England Biolabs M0201S
T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase) New England Biolabs M0204
T4 RNA ligase 2, truncated KQ New England Biolabs M0373
Thermomixer Eppendorf ThermoMixer C with ThermoTop
Thymidine Sigma-Aldrich T9250
Tris-borate-EDTA buffer (TBE) TaKara T9122
Triton X-100 Promega H5142
Ultralink Protein A sepharose beads Thermo Fisher Scientific 22810 Protein A beads
Ultrasonicator Bioruptor
Urea Bio-basic UB0148
Vortex mixer DAIHAN Scientific VM-10
Xylene cyanol Sigma-Aldrich X4126
γ-32P-ATP (10 μCi/μL, 3.3 μM) PerkinElmer BLU502A100UC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meurs, E. F., et al. Constitutive expression of human double-stranded RNA-activated p68 kinase in murine cells mediates phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 and partial resistance to encephalomyocarditis virus growth. Journal of Virology. 66 (10), 5805-5814 (1992).
  2. Patel, R. C., Stanton, P., McMillan, N. M., Williams, B. R., Sen, G. C. The interferon-inducible double-stranded RNA-activated protein kinase self-associates in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (18), 8283-8287 (1995).
  3. Bennett, R. L., Pan, Y., Christian, J., Hui, T., May, W. S. The RAX/PACT-PKR stress response pathway promotes p53 sumoylation and activation, leading to G(1) arrest. Cell Cycle. 11 (1), 407-417 (2012).
  4. Yang, X., Nath, A., Opperman, M. J., Chan, C. The double-stranded RNA-dependent protein kinase differentially regulates insulin receptor substrates 1 and 2 in HepG2 cells. Molecular and Cellular Biology. 21 (19), 3449-3458 (2010).
  5. Zamanian-Daryoush, M., Mogensen, T. H., DiDonato, J. A., Williams, B. R. G. NF-kappa B Activation by Double-Stranded-RNA-Activated Protein Kinase (PKR) Is Mediated through NF-kappa B-Inducing Kinase and Ikappa B Kinase. Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1278-1290 (2000).
  6. Takada, Y., Ichikawa, H., Pataer, A., Swisher, S., Aggarwal, B. B. Genetic deletion of PKR abrogates TNF-induced activation of IkappaBalpha kinase. JNK, Akt and cell proliferation but potentiates p44/p42 MAPK and p38 MAPK activation. Oncogene. 26 (8), 1201-1212 (2007).
  7. Dabo, S., Meurs, E. F. dsRNA-dependent protein kinase PKR and its role in stress, signaling and HCV infection. Viruses. 4 (11), 2598-2635 (2012).
  8. Black, T. L., Safer, B., Hovanessian, A., Katze, M. G. The Cellular 68,000-Mr Protein-Kinase Is Highly Autophosphorylated and Activated yet Significantly Degraded during Poliovirus Infection - Implications for Translational Regulation. Journal of Virology. 63 (5), 2244-2251 (1989).
  9. Bando, Y., et al. Double-strand RNA dependent protein kinase (PKR) is involved in the extrastriatal degeneration in Parkinson's disease and Huntington's disease. Neurochemistry International. 46 (1), 11-18 (2005).
  10. Onuki, R., et al. An RNA-dependent protein kinase is involved in tunicamycin-induced apoptosis and Alzheimer's disease. The EMBO Journal. 23 (4), 959-968 (2004).
  11. Peel, A. Activation of the cell stress kinase PKR in Alzheimer's disease and human amyloid precursor protein transgenic mice. Neurobiology of Disease. 14 (1), 52-62 (2003).
  12. Peel, A. L. Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, binds preferentially to Huntington's disease (HD) transcripts and is activated in HD tissue. Human Molecular Genetics. 10 (15), 1531-1538 (2001).
  13. Suen, K. C., Yu, M. S., So, K. F., Chang, R. C., Hugon, J. Upstream signaling pathways leading to the activation of double-stranded RNA-dependent serine/threonine protein kinase in beta-amyloid peptide neurotoxicity. Journal of biological chemistry. 278 (50), 49819-49827 (2003).
  14. Nakamura, T., et al. A critical role for PKR complexes with TRBP in Immunometabolic regulation and eIF2alpha phosphorylation in obesity. Cell Reports. 11 (2), 295-307 (2015).
  15. Saito, S. Enhancement of the interferon-induced double-stranded RNA-dependent protein kinase activity by Sindbis virus infection and heat-shock stress. Microbiology and Immunology. 34 (10), 859-870 (1990).
  16. Youssef, O. A., et al. Potential role for snoRNAs in PKR activation during metabolic stress. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (16), 5023-5028 (2015).
  17. Murtha-Riel, P., Davies, M. V., Choi, S. Y., Hershey, J. W., Kaufman, R. J. Expression of a Phosphorylation-resistant Eukaryotic Initiation Factor 2 a-Subunit Mitigates Heat Shock Inhibition of Protein Synthesis. The Journal of Biological Chemistry. 268, 12946-12951 (1993).
  18. Benkirane, M., et al. Oncogenic potential of TAR RNA binding protein TRBP and its regulatory interaction with RNA-dependent protein kinase PKR. The EMBO Journal. 16 (3), 611-624 (1997).
  19. Koromilas, A., Roy, S., Barber, G., Katze, M., Sonenberg, N. Malignant transformation by a mutant of the IFN-inducible dsRNA-dependent protein kinase. Science. 257 (5077), 1685-1689 (1992).
  20. Kim, Y., et al. PKR is activated by cellular dsRNAs during mitosis and acts as a mitotic regulator. Genes & Development. 28 (12), 1310-1322 (2014).
  21. Kim, Y., et al. Deletion of human tarbp2 reveals cellular microRNA targets and cell-cycle function of TRBP. Cell Reports. 9 (3), 1061-1074 (2014).
  22. Zhu, P. J., et al. Suppression of PKR promotes network excitability and enhanced cognition by interferon-gamma-mediated disinhibition. Cell. 147 (6), 1384-1396 (2011).
  23. Dagon, Y., et al. Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, down-regulates CDC2/cyclin B1 and induces apoptosis in non-transformed but not in v-mos transformed cells. Oncogene. 20 (56), 8045-8056 (2001).
  24. Elbarbary, R. A., Li, W., Tian, B., Maquat, L. E. STAU1 binding 3' UTR IRAlus complements nuclear retention to protect cells from PKR-mediated translational shutdown. Genes & Development. 27 (13), 1495-1510 (2013).
  25. Cho, J., et al. LIN28A is a suppressor of ER-associated translation in embryonic stem cells. Cell. 151 (4), 765-777 (2012).
  26. Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
  27. Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
  28. Kim, Y., et al. PKR Senses Nuclear and Mitochondrial Signals by Interacting with Endogenous Double-Stranded RNAs. Molecular Cell. 71 (6), 1051-1063 (2018).
  29. Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
  30. Ricci, E. P., et al. Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).
  31. Kim, B., Kim, V. N. fCLIP-seq for transcriptomic footprinting of dsRNA-binding proteins: Lessons from DROSHA. Methods. , (2018).
  32. Dhir, A., et al. Mitochondrial double-stranded RNA triggers antiviral signalling in humans. Nature. 560 (7717), 238-242 (2018).

Tags

ביוכימיה גיליון 145 כפול גדילי RNA רנ א מיטוכונדריאלי RNA מחייב חלבון אינטראקציה RNA-RBP חלבון קינאז RNA מופעל ע י crosslinking פורמלדהיד מחזור התא סטראנד ספציפיים לרביעיית-PCR
לומד RNA Interactors של חלבון ה-RNA-מופעל במהלך מחזור התא בתרבית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, S., Kang, M., Kim, Y. Studying… More

Kim, S., Kang, M., Kim, Y. Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle. J. Vis. Exp. (145), e59215, doi:10.3791/59215 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter