Vi presenterar experimentella metoder för att studera RNA-interactmedlemmar dubbelsträngat RNA-bindande protein Kinas RNA-aktiverat (PKR) under mammalian cell cykel använder HeLa cells. Denna metod använder tredjeparts formaldehyd crosslink RNA-PKR komplex och immunoprecipitation att berika PKR-bundna RNAs. Dessa RNAs kan analyseras vidare genom hög genomströmning sekvensering eller qRT-PCR.
Proteinkinas RNA-aktiverat (PKR) är medlem i de medfödda immunförsvaret proteinerna och erkänner det dubbelsträngat sekundära strukturerar av viral RNAs. PKR när bunden till viral dubbelsträngat RNA (dsRNAs), och genomgår dimerization och efterföljande autophosphorylation. Fosforyleras PKR (pPKR) blir aktiv och inducerar fosforylering av den alfa subuniten av eukaryota inledande faktor 2 (eIF2α) att undertrycka globala översättning. Ökande bevis föreslår att PKR kan aktiveras under fysiologiska betingelser såsom under cellcykeln eller olika stress villkor utan infektion. Vår förståelse av de RNA aktivatorer av PKR är dock begränsad på grund av en standardiserad experimentell metod att fånga och analysera PKR-interagera dsRNAs. Här presenterar vi en experimentell protokollet att specifikt berika och analysera PKR bundet RNAs under cellcykeln använder HeLa cells. Vi använder effektiv crosslinking aktiviteten av formaldehyd att fixa PKR-RNA komplex och isolera dem via immunoprecipitation. PKR co-immunoprecipitated RNAs kan sedan bearbetas vidare för att generera en hög genomströmning sekvensering bibliotek. En stor klass av PKR-interagera cellulär dsRNAs är mitokondriell RNAs (mtRNAs), som kan existera som intermolekylära dsRNAs genom kompletterande interaktion mellan de tunga-strand och ljus-strand RNASEN. För att studera strandedness av dessa duplex mtRNAs, presenterar vi också ett protokoll för strand-specifika qRT-PCR. Våra protokoll är optimerad för analys av PKR-bundna RNAs, men det kan enkelt modifieras för att studera cellulära dsRNAs eller RNA-interactmedlemmar av andra dsRNA bindande proteiner.
Proteinkinas RNA-aktiverat (PKR), även känd som eukaryota inledande faktor 2-alpha kinase 2 (EIF2AK2), är en välkarakteriserad proteinkinas som överför information från RNAs. Det hör hemma till den eukaryota översättning inledande 2 subenhet alpha (eIF2α) Kinas familj och phosphorylates eIF2α på Serin 51 svar på infektion att undertrycka globala översättning1. I detta sammanhang aktiveras PKR genom viral dubbelsträngat RNA (dsRNAs), som tillhandahåller en plattform för PKR dimerization och autophosphorylation2. Förutom eIF2α, kan PKR också fosforylera p53, insulin receptor substrate 1, hämmare κB och c-Jun N-terminal kinase (JNK) att reglera aktiviteten hos många signaltransduktion vägar3,4,5, 6.
PKR identifierades ursprungligen som en Kinas som fosforyleras eIF2α under poliovirus infektion genom att erkänna poliovirus’ dsRNAs7,8. PKR är alltmer hittade för att spela mångfacetterade roller utöver immunsvar och dess avvikande aktivering eller funktionsfel är underförstått i talrika mänskliga sjukdomar. Aktiveras/Phosphorylated PKR (pPKR) observeras ofta under apoptos och är ett gemensamt kännetecken för patienter med degenerativa sjukdomar, särskilt neurodegenerativa sjukdomar som Huntingtons, Parkinsonss och Alzheimers sjukdom9 ,10,11,12,13. Dessutom aktiveras PKR villkor olika stress såsom metabol stress och värme chock14,15,16,17. Däremot, resulterar hämning av PKR i ökad cellproliferation och även elakartad omformning18,19. PKR funktion är också viktigt för normal hjärnfunktion och under cellcykeln som nivån på pPKR är förhöjd under M fas20,21,22. I detta sammanhang pPKR dämpar globala översättning och ger ledtrådar till viktiga mitotiska signalering system som krävs för korrekt celldelningen20. Dessutom resulterade långvarig aktivering av PKR i G2/M fas cellcykelarrest i Chinese hamster ovary cells23. PKR fosforylering regleras följaktligen den negativ feedback-slingan för att säkerställa snabb inaktivering under M/G1 övergången21.
Trots den breda utbud av PKR funktionen är vår förståelse av PKR aktiveringen begränsad på grund av avsaknaden av en standardiserad hög genomströmning experimentell metod att fånga och identifiera dsRNAs kan aktivera PKR. Tidigare studier har visat att PKR kan interagera med dsRNAs bildas av två inverterad Alu repetitioner (IRAlus)20,24, men möjligheten att förekomsten av ytterligare cellulära dsRNAs kan aktivera PKR under cellcykeln eller under stress villkor i mänskliga celler var outforskat. Den konventionella metoden att identifiera RNA-interactmedlemmar av en RNA-bindande protein (RBP) använder UV-ljus till crosslink RNA-RBP komplex25,26,27. En nyligen genomförd studie tillämpas detta UV crosslinking tillvägagångssätt i ett mus-system och identifierat att små nukleolära RNAs kan reglera PKR aktivering under metabol stress16. Genom att utnyttja hög crosslinking effektivitet av formaldehyd, presenterade vi en alternativ metod för att identifiera PKR-interagera RNAs under cellcykeln i HeLa celler28. En liknande metod har tillämpats för att studera andra dsRBPs såsom Staufen och Drosha29,30,31. Vi hittade att PKR kan interagera med olika typer av icke-kodande RNAs såsom kort interspersed nukleära element (sinus), lång interspersed nukleära element (linje), endogena retrovirus element (ERV) och även alpha-satellit RNAs. Dessutom visade vi att PKR kan interagera med mitokondriell RNAs (mtRNAs), vilken form intermolekylära dsRNAs genom kompletterande interaktion mellan de tunga-strand och ljuset strand RNAs28. En ny publikation stöds ytterligare våra data att vissa mtRNAs finns i en dubbelsidig form och kan aktivera dsRNA sensorer såsom melanom differentiering-associerade protein 5 att inducera interferoner32. Viktigare, moduleras uttryck och subcellulär lokalisering av mtRNAs under cellcykeln och av olika stressfaktorer, som kan vara viktiga i deras förmåga att reglera PKR aktiveringen28.
I denna artikel presenterar vi ett detaljerat protokoll för en nyligen utvecklad formaldehyd crosslinking och immunoprecipitation (fCLIP) metod för att fånga och analysera PKR-interagera RNAs under cellcykeln. Vi visar metoden för att förbereda cellcykeln gripandet prover med tymidin och nocodazole. Vi presenterar sedan fCLIP processen för att isolera PKR-bundna RNAs och en metod för att förbereda hög genomströmning sekvensering bibliotek för att identifiera dessa RNAs. Dessutom avgränsa vi detaljerade förfaranden för att analysera PKR-bundna RNAs med qRT-PCR. Specifikt, presenterar vi en strand-specifika omvänd transkription procedur för att analysera strandedness av mtRNAs. Protokollet beskrivs är optimerad för HeLa cells och PKR, men viktiga steg såsom utarbetandet av cellcykeln prov, fCLIP och strand-specifika qRT-PCR-analys kan enkelt modifieras att studera cellulära dsRNAs eller för att identifiera RNA interactmedlemmar av andra dsRBPs.
Processen att förbereda S eller M fas-greps prover illustreras i figur 1. För att arrestera celler på S fasen, använde vi en tymidinanalog dubbel block metod där vi behandlade celler med tymidin två gånger med en 9 h release emellan för att säkerställa hög gripandet effektivitet (figur 1A). För M fas gripande, vi behandlade celler en gång med tymidin följt av en 9 h release och sedan tillämpas nocodazole block celler på metafasen (<strong class="…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av grundläggande vetenskap forskningsprogram genom den nationella Research Foundation i Korea (NRF) finansieras av den koreanska regeringen ministeriet för vetenskap och IKT (NRF-2016R1C1B2009886).
0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
1 M Tris, pH 7.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
1 M Tris, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
10% Nonidet-p40 (NP-40) | Biosolution | BN015 | |
10% Urea-acrylamide gel solution | 7 M (w/v) Urea and 0.5X TBE, stored protected from light at 4 °C | ||
10X DNA loading buffer | TaKaRa | 9157 | |
15 mL conical tube | SPL | 50015 | |
3' adaptor | 5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3' | ||
3 M Sodium Acetate pH 5.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9740 | |
5' adaptor | 5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3' | ||
5 M NaCl | Thermo Fisher Scientific | AM9760G | |
50 mL conical tube | SPL | 50050 | |
Acid-phenol chloroform, pH 4.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9722 | |
Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads DNA/RNA clean up |
Antarctic alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0289S | |
Anti-DGCR8 | Made in house | ||
Anti-PKR (D7F7) | Cell signaling technology | 12297S | |
Anti-PKR (Milli) | Millipore EMD | 07-151 | |
ATP (100 mM) | GE Healthcare | GE27-2056-01 | |
Bromophenol blue sodium salt | Sigma-aldrich | B5525 | |
Calf intestinal alkaline phosphatase | TaKaRa | 2250A | |
Cell scraper 25 cm 2-position | Sarstedt | 83.183 | |
CMV promoter sequence | 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3' | ||
Dulbecco's modified eagle medium | Welgene | LM001-05 | |
dNTP mixture (2.5 mM) | TaKaRa | 4030 | |
Ethanol, Absolute, ACS Grade | Alfa-Aesar | A9951 | |
Fetal bovine serum | Merck | M-TMS-013-BKR | |
Formamide | Merck | 104008 | |
Glycine | Bio-basic | GB0235 | |
GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | AM9516 | |
Isopropanol | Merck | 8.18766.1000 | |
NEBNext rRNA Depletion Kit | New England Biolabs | E6318 | rRNA Depletion Kit |
Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
Normal rabbit IgG | Cell signaling technology | 2729S | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 6148 | |
PCR forward primer (RP1) | 5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3' | ||
PCR index reverse primer (RPI) | 5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3' | ||
PCR tubes with flat cap, 0.2 mL | Axygen | PCR-02-C | |
Phosphate bufered saline (PBS) Tablet | TaKaRa | T9181 | |
Phusion high-fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | High-fidelity polymerase |
PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotor | Benchmark | c2000 | |
Polynucleotide kinase (PNK) | TaKaRa | 2021A | |
Protease inhibitor cocktail set III | Merck | 535140-1MLCN | |
Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma-Aldrich | 3115879001 | |
qPCR primer sequence: CO1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: CO1 Light | Forward/Reverse: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: CO2 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: CO2 Light | Forward/Reverse: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: CO3 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: CO3 Light | Forward/Reverse: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: CYTB Heavy | Forward/Reverse: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: CYTB Light | Forward/Reverse: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: GAPDH | Forward/Reverse: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: ND1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: ND1 Light | Forward/Reverse: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: ND4 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: ND4 Light | Forward/Reverse: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: ND5 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: ND5 Light | Forward/Reverse: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: ND6 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: ND6 Light | Forward/Reverse: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
Random hexamer | Thermo Fisher Scientific | SO142 | |
Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/μL) | TaKaRa | 2270A | |
Recombinant Rnase inhibitor (40 U/μL) | TaKaRa | 2313A | |
Ribo-Zero rRNA Removal Kit | Illumina | MRZH116 | rRNA Removal Kit |
Rotator | FINEPCR, ROTATOR AG | D1.5-32 | |
RT primer sequence: CO1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′ | ||
RT primer sequence: CO1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′ | ||
RT primer sequence: CO2 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′ | ||
RT primer sequence: CO2 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′ | ||
RT primer sequence: CO3 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′ | ||
RT primer sequence: CO3 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′ | ||
RT primer sequence: CYTB Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′ | ||
RT primer sequence: CYTB Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′ | ||
RT primer sequence: GAPDH | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′ | ||
RT primer sequence: ND1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′ | ||
RT primer sequence: ND1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′ | ||
RT primer sequence: ND4 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′ | ||
RT primer sequence: ND4 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′ | ||
RT primer sequence: ND5 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3′ | ||
RT primer sequence: ND5 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′ | ||
RT primer sequence: ND6 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′ | ||
RT primer sequence: ND6 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′ | ||
Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tube | Bio Plas | 4167SLS50 | |
Sodium dedecyl sulfate | Biosesang | S1010 | |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
SUPERase In Rnase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | AM2694 | |
SuperScript III reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18080093 | Reverse transcriptase for library preparation |
SuperScript IV reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | Reverse transcriptase for qRT-PCR |
SYBR gold nucleic acid gl stain | Thermo Fisher Scientific | S11494 | |
T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204 | |
T4 RNA ligase 2, truncated KQ | New England Biolabs | M0373 | |
Thermomixer | Eppendorf ThermoMixer C with ThermoTop | ||
Thymidine | Sigma-Aldrich | T9250 | |
Tris-borate-EDTA buffer (TBE) | TaKara | T9122 | |
Triton X-100 | Promega | H5142 | |
Ultralink Protein A sepharose beads | Thermo Fisher Scientific | 22810 | Protein A beads |
Ultrasonicator | Bioruptor | ||
Urea | Bio-basic | UB0148 | |
Vortex mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
γ-32P-ATP (10 μCi/μL, 3.3 μM) | PerkinElmer | BLU502A100UC |