Summary
Ici, nous décrivons un analyse de croissance des plantes hydroponiques pour quantifier la présence des espèces et visualiser la répartition spatiale des bactéries lors de la colonisation initiale des racines des plantes et après leur transfert dans différents environnements de croissance.
Abstract
Les bactéries forment des microbiomes rhizosphèrecomplexes façonnés par des microbes en interaction, des organismes plus gros et l'environnement abiotique. Dans des conditions de laboratoire, la colonisation de la rhizosphère par des bactéries favorisant la croissance des plantes (PGPB) peut augmenter la santé ou le développement de plantes hôtes par rapport aux plantes non colonisées. Cependant, dans les milieux de terrain, les traitements bactériens avec PGPB souvent ne fournissent pas d'avantages substantiels aux cultures. Une explication est que cela peut être dû à la perte de la PGPB lors d'interactions avec les microbes du sol endogène au cours de la durée de vie de la plante. Cette possibilité a été difficile à confirmer, puisque la plupart des études se concentrent sur la colonisation initiale plutôt que sur le maintien du PGPB dans les communautés de rhizosphère. On suppose ici que l'assemblage, la coexistence et le maintien des communautés bactériennes sont façonnés par les caractéristiques déterministes du microenvironnement de la rhizosphère, et que ces interactions peuvent avoir un impact sur la survie du PGPB dans les milieux indigènes. Pour étudier ces comportements, un analyse hydroponique de croissance des plantes est optimisée en utilisant Arabidopsis thaliana pour quantifier et visualiser la distribution spatiale des bactéries lors de la colonisation initiale des racines des plantes et après le transfert vers une croissance différente Environnements. La reproductibilité et l'utilité de ce système sont ensuite validées avec le PGPB Pseudomonas simiaebien étudié. Étudier comment la présence de plusieurs espèces bactériennes peut affecter la dynamique de colonisation et d'entretien sur la racine de la plante, une communauté modèle de trois souches bactériennes (un Arthrobacter, Curtobacterium, et Microbacterium espèces) à l'origine isolée de la rhizosphère A. thaliana est construite. Il est démontré que la présence de ces diverses espèces bactériennes peut être mesurée à l'aide de cet analyse hydroponique de la mainntuence des plantes, qui offre une alternative aux études communautaires bactériennes basées sur le séquençage. De futures études utilisant ce système pourraient améliorer la compréhension du comportement bactérien dans les microbiomes végétaux multispécifiques au fil du temps et dans les conditions environnementales changeantes.
Introduction
La destruction des cultures par les maladies bactériennes et fongiques entraîne une baisse de la production alimentaire et peut gravement perturber la stabilité mondiale1. Sur la base de la découverte que les microbes dans les sols suppressifs sont responsables de l'augmentation de la santé des plantes2, les scientifiques ont demandé si le microbiome végétal peut être exploité pour soutenir la croissance des plantes en modifiant la présence et l'abondance de particulier espèces bactériennes3. Les bactéries qui aident à la croissance ou au développement des plantes sont collectivement appelées bactéries favorisant la croissance des plantes (PGPB). Plus récemment, des études sont passées de la simple identification du PGPB potentiel à la compréhension de la façon dont les interactions inter-royaumes dans le sol, autour des racines ou dans la rhizosphère (la zone qui entoure directement et y compris la surface racinaire) peuvent avoir un impact sur le PGPB. activité4.
La colonisation de la rhizosphère par pgPB peut augmenter la santé ou le développement des plantes hôtes en réponse à divers facteurs de stress par rapport aux plantes non colonisées5. Cependant, les résultats sont souvent plus variables dans les conditions du sol indigène par rapport à ceux observés dans les serres et laboratoires étroitement contrôlés6. Une hypothèse pour cette différence est que la croissance ou le comportement de PGPB peut être inhibé par les bactéries indigènes du sol ou des champignons dans les champs7,8. Les effets bénéfiques des bactéries de la rhizosphère dépendent généralement de la capacité des bactéries à localiser et à se déplacer vers la racine, 2) coloniser la racine par la formation de biofilms, et 3) interagir avec la plante hôte ou des agents pathogènes par la production de petites molécules métabolites7,9. N'importe lequel de ces comportements de colonisation peut être affecté par la présence et l'activité des microbes voisins10.
Nous avons conçu un système pour quantifier et visualiser ces stades distincts de colonisation bactérienne de la rhizosphère (Figure 1). Cette approche facilitera les études sur les raisons pour lesquelles l'entretien à long terme du PGPB n'est pas parfois observé après le transfert des plantes dans de nouveaux environnements, comme lors de la plantation de semis pré-inoculés. Arabidopsis thaliana comme ont été choisis comme un modèle végétal en raison de son utilisation intensive dans les études de laboratoire ainsi que les nombreuses données disponibles sur ses interactions microbiennes11. Il y a trois étapes dans le système : 1) a. thaliana croissance, 2) la colonisation bactérienne, et 3) l'entretien bactérien (voir la figure 1). Parce que A. thaliana est une plante terrestre, il était important de s'assurer qu'il ne souffrait pas de stress hydrique indu dans le système hydroponique12. Inspirés par les méthodes utilisées par Haney et coll.13, les semis sont cultivés sur des mailles en plastique pour séparer la pousse du milieu de croissance liquide. Ce système ne semble pas compromettre la santé et le développement de l'hôte de la plante, et il améliore la croissance de A. thaliana dans le liquide11. Lorsque la pousse de la plante flotte au-dessus de la surface, les racines sont pleinement exposées à la colonisation par des bactéries inoculées dans le milieu de croissance bactérienne liquide. Cela permet d'examiner les bactéries d'intérêt pour la colonisation des nutriments qui sont les plus propices à la croissance, tout en changeant les conditions pour permettre à la plante de continuer à croître dans un milieu nutritif conçu pour soutenir sa croissance. Les deux étapes comprennent des secousses régulières pour prévenir l'anoxie de la racine13. Les bactéries peuvent être visualisées ou quantifiées à partir des racines des plantes après le transfert du milieu de colonisation ou du milieu d'entretien. Ce système hydroponique est très flexible, permettant aux conditions expérimentales et aux contraintes appliquées d'être facilement modifiées en fonction des intérêts des chercheurs.
Cette méthode décrite est importante dans le contexte de l'ensemble de la littérature sur les interactions plantes-microbe, car elle fournit un système robuste pour étudier ces interactions à la surface des racines tout en étant personnalisable aux préférences de croissance de bactéries différentes. Les laboratoires de biologie végétale effectuent souvent des expériences de colonisation des microbes végétaux sur l'agar solide, ne permettant que le mouvement planaire (si cela) des bactéries tout en exigeant la manipulation potentiellement destructrice des plantes lors du transfert ultérieur. En revanche, les laboratoires de microbiologie ont souvent donné la priorité à la santé des bactéries dans leurs expériences, au détriment des plantes14,15. Ces différentes priorités des laboratoires axés sur les plantes et la microbiologie ont historiquement rendu difficile la comparaison des résultats entre ces groupes, puisque chacun optimise généralement les conditions expérimentales pour optimiser leur organisme d'intérêt15. Le système flottant-mesh-plant-croissance décrit ici empêche la submersion complète de plante, un avantage notable aux études microbiologiques précédentes, tout en optimisant temporairement la croissance et la survie des bactéries pour faciliter la colonisation. Ainsi, l'analyse que nous présentons ici peut répondre aux préoccupations des biologistes des plantes (sur la surhydratation et la manipulation tactile de la plante) tout en répondant aux critères des microbiologistes (permettant différentes conditions de croissance bactérienne et de multiples interactions des espèces)7. Ce protocole est conçu pour être adaptable pour une utilisation avec diverses bactéries, plantes et conditions environnementales.
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Protocol
REMARQUE : La configuration expérimentale est décrite pour plus de clarté et utilisée pour générer les résultats représentatifs inclus dans ce rapport, mais les conditions peuvent être modifiées comme vous le souhaitez. Toutes les étapes doivent être effectuées à l'aide de l'EPI et en suivant les reccomendations institutionnelles et fédérales pour la sécurité, selon le statut BSL des bactéries utilisées.
1. Caractérisation des bactéries
- Déterminer la morphologie des bactéries sur la plaque d'agar moyenne de croissance. Resuspendre les cellules à un OD approximatifde 600 à 0,5 et plaquer un volume de 1 L sur le milieu d'agar de choix. Ajouter X-gal aux plaques d'agar à une concentration finale de 20 mg/mL pour mieux différencier les membres individuels de la communauté bactérienne spécifique. Cultivez à 24 oC ou 30 oC jusqu'à ce que des colonies se forment, puis prenez des photos et des notes sur la morphologie des colonies.
- Définir la corrélation entre la densité optique de chaque souche bactérienne et le nombre d'unités de formation de CFU (colonies) par mL16. Resuspendre les bactéries dans 1 ml d'eau dans une plaque de 24 puits à un OD approximatifde 600 à 5, effectuer des dilutions en série à deux volets, surveiller OD600 de toutes les dilutions, et la plaque chacune pour déterminer le CFU/mL viable dans chaque échantillon à de multiples densités optiques.
- Déterminer la tolérance maximale à la sonication pour chaque souche bactérienne. Pour ce faire, les cellules aliquot dans une plaque de 24 puits contenant milieu liquide, réservant certaines cellules comme un échantillon de contrôle non soniqueux. À l'aide d'un ultrasonateur avec une fixation de corne à 24 pointes, appliquer trois tours de 12 s de sonication à 40 ampères avec 2 impulsions.
REMARQUE : Il est conseillé d'utiliser un ultrasonateur de 24 puits pour faciliter le multiplexage en aval des échantillons d'usines de traitement, mais si l'un d'eux n'est pas disponible, utilisez un ultrasonateur équipé d'un micropointe et effectuez chaque sonication d'échantillon indépendamment. Portez toujours des cache-oreilles évalués à au moins 25 protections NRR. - Effectuez des dilutions sérielles 10 fois des échantillons sonicated et non sonicated et tachez sur des plaques d'agar. Déterminer s'il y a une réduction des cellules viables après la sonication. Si c'est le cas, utilisez un échantillon frais et répétez l'étape de sonication en utilisant un temps de sonication total réduit ou une amplitude jusqu'à ce que le traitement n'ait aucun effet sur cFU/mLfinal 17.
2. Préparation des semis Arabidopsis thaliana sur un maillage en plastique
- Créez des disques de maille en plastique à l'aide d'un poinçonneur de trou standard.
- Recueillir les disques dans un récipient en verre avec un couvercle lâche de papier d'aluminium, et stériliser à l'aide d'un autoclave réglé à un cycle sec de 20 min13.
- À l'aide d'une pince à épiler stérilisée à la flamme, distribuez environ 40 disques de maille stérilisés en une seule couche sur la surface d'une plaque d'agar à croissance végétale moyenne. Utilisez 0,5x sels de Murashige et de Skoog (MS), contenant 500 mg/L de tampon MES [2-(N-morpholino)ethanesulfonic acide] et 1,5% Bacto agar, comme milieu de croissance des plantes, avec 50 g/mL de bénomyl ajouté à la contamination fongique limite des semis.
- Préparer les graines hacheniques de A. thaliana comme décrit précédemment17.
- Placer environ 100 à 300 graines chacune dans des tubes de centrifugeuse individuels dans une grille et placer dans un récipient en verre refermable ou en plastique lourd (« pot ») dans un capuchon de fumée.
- Par prudence, placer un bécher de 100 ml d'eau de Javel dans le bocal, ajouter 3 ml de HCl concentré à l'eau de Javel, et sceller immédiatement le pot et laisser les vapeurs stériliser les graines pendant au moins 4 h.
- Retirez soigneusement les tubes de graines stérilisées sous le bocal et scellez.
- Placer deux graines au centre de chaque maillage. Scellez les plaques avec du ruban adhésif chirurgical et incuber pendant 2 à 6 jours à 4 oC dans l'obscurité pour vernaliser les graines.
- Pour germer et cultiver les semis, placez le côté agar de plaque vers le bas dans une chambre de croissance de plante pendant 8-10 jours dans des arrangements courts de jour : 9 h de lumière à 21 oC et 15 h d'obscurité à 18 oC (figure1, étape 2).
3. Colonisation des plantes dans le milieu de croissance bactérienne liquide
- Ajouter 1 ml de milieu de croissance bactérienne à chaque puits d'une plaque stérile de 24 puits, à l'exception des puits témoins à faible intensité de médias seulement. Utilisez Lennox Luria Broth (10 g de tryptone, 5 g d'extrait de levure, 5 g de NaCl) comme milieu de croissance bactérienne.
- Transférer les semis germés enmaillés dans le maillage des plaques d'agar au liquide (figure1, étape 3a).
- Épluchez délicatement la maille contenant deux semis germés vers le haut et hors de la plaque d'agar à l'aide de forceps stérilisés par flamme. Choisissez un maillage avec des semis de taille égale et intact.
- Si l'enlèvement de l'agar n'est pas lisse, jetez ce maillage et plantez. Transférer un flotteur dans chaque puits de liquide de croissance bactérienne, côté racine vers le bas.
- Inoculer les bactéries dans les puits contenant des semis flottants.
- Resuspendre les bactéries cultivées du jour au lendemain sur des plaques d'agar à un OD600 équivalent à 108 CFU/mL dans le liquide moyen de croissance bactérienne. Ajouter 10 ll de suspension bactérienne à chaque puits pour une concentration finale de 106 bactéries CFU par puits.
- Si vous préparez un mélange de bactéries, suspendez-les chacune à l'OD600 équivalant à 108 CFU/mL, mélangez dans des proportions égales, et ajoutez 10 L du mélange final par puits de liquide.
- Sceller la plaque pour une croissance stérile. Sans toucher le côté collant, appuyez soigneusement sur le film perméable au gaz sur la plaque. Assurez-vous que chaque puits a été scellé individuellement en appliquant une pression autour de chacun des anneaux fabriqués par les puits. Remplacer le couvercle en plastique de la plaque confortablement sur la plaque et le film perméable au gaz (Figure 1, étape 3b).
- Incuber les plaques pendant 18 h dans une chambre de croissance des plantes, dans les mêmes conditions que les semis ont été germés à l'origine, sauf sur un shaker de plaque orbitale réglé à 220 tr/min.
4. Maintien de la colonisation bactérienne
- Pour rincer tous les flotteurs (plantes sur maille), ajouter 1 ml d'eau stérile aux puits d'une nouvelle plaque de 24 puits. Enlever le film perméable au gaz. À l'aide de forceps stériles, transférer les flotteurs vers les puits avec de l'eau (figure1, étape 4a). Rincer en vous reposant 10 min à température ambiante (RT) sans agitation.
REMARQUE : Pour déterminer l'efficacité bactérienne de colonisation des racines plutôt que leur capacité à maintenir la colonisation au fil du temps, les plantes peuvent être sacrifiées à cette étape en les prenant directement à l'étape 5.1. - Remplir les puits d'une nouvelle plaque de 24 puits avec 1 ml de milieu de croissance des plantes. Transférer un maillage à chaque puits. Couvrir d'un joint perméable au gaz et couver pendant 72 h sur le shaker de plaque orbitale à 220 tr/min dans la chambre de croissance des plantes (figure1, étape 4b).
- Répétez le rinçant tel qu'il est effectué à l'étape 4.1 avec des flotteurs après la période d'incubation de 72 h.
5. Collecte de bactéries pour des comptes cellulaires viables
REMARQUE : Le nombre de bactéries par racine de semis peut être déterminé à n'importe quel point d'incubation. La colonisation peut être surveillée entre 0 h et 18 h, tandis que l'entretien peut être surveillé à partir de 18 h. Les plantes destinées à l'imagerie peuvent passer directement à l'article 6.
- Retirez les semis du maillage (Figure 1, étape 5). Placez délicatement les pincements à flammes sous les feuilles (mais sur le côté de la feuille de la maille) et pincez légèrement la tige. Remuer les semis vers le haut et loin de la maille pour déloger la racine sans la casser. Si la racine se brise, gratter doucement le fond de maille pour recueillir toute la longueur.
- Enlever les bactéries des racines des plantes. Transférer les bactéries dans les puits d'une plaque de 24 puits contenant 1 ml de ddH20. Sonicate les échantillons tels que décrits à l'étape 1.3.
REMARQUE : À l'aide d'un microscope, recherchez les bactéries restantes sur la surface de la racine sur un échantillon sonicated. Si les bactéries demeurent, augmentez le temps de sonication total ou l'intensité jusqu'à ce qu'aucune bactérie ne reste liée, jusqu'au niveau le plus élevé de sonication qui n'affecte pas le nombre de cellules viables tel que déterminé à la section 1. - Quantifier les bactéries sur les racines.
- Effectuez des dilutions sérielles de 10 fois des échantillons sonicated jusqu'à une dilution de 10-6 dans le milieu de croissance bactérienne. Ajouter 50 l de chaque dilution dans des plaques d'agar individuelles et les étaler avec des perles de verre stériles (ou un épandeur bactérien). Incuber les plaques à la température optimale pour les bactéries jusqu'à ce que les colonies individuelles soient comptées.
- Une fois distinguable, compter le nombre de chaque morphologie de chaque colonie (tel que déterminé à la section 1) et calculer l'UFC de chaque espèce bactérienne par semis. Jetez tous les échantillons montrant une contamination, car la contamination pendant la colonisation ou l'entretien peut affecter la présence bactérienne.
6. Collection de racines végétales intactes pour la microscopie
- À l'aide de forceps, retirer les semis du maillage comme à l'article 5.
- Transférer chaque plante sur des lames de microscope.
- Placez la pointe de la racine sur la glissière et éloignez-vous de la pointe pour régler la pousse avec la glissière, assurant ainsi une racine redressée pour une meilleure imagerie. Ajouter une goutte d'eau ou un milieu de croissance des plantes stériles aux échantillons pour hydrater les interfaces entre les couvertures et les lames.
- Placez un bordereau en verre juste au-dessus de la couronne racine (région la plus en boîte supérieure dans la figure 1) et au-dessous des feuilles de pousse pour éviter l'inclinaison de la couverture (pour permettre l'imagerie de la couronne racine), et appuyez doucement vers le bas17.
- Si vous utilisez des bactéries fluorescentes, imagez à l'aide de filtres d'excitation/émission appropriés pour différencier les bactéries les unes des autres et de la racine végétale18.
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Representative Results
Le PGPB P. simiae WCS417r bien caractérisé est connu pour coloniser les racines de A. thaliana dans la culture hydroponique. Cette bactérie naturellement fluorescente peut facilement être visualisée à l'aide de microscopie sur les racines des semis après la colonisation (figure 2). Bien qu'il soit possible d'imaginer toute la longueur de ces racines de semis A. thaliana (4 à 6 mm de longueur), cela prendrait un temps prohibitif pour de nombreuses plantes. Étant donné que la plupart des variations entre les points de temps et les espèces de bactéries peuvent être capturées par l'imagerie de la couronne, du milieu et de la pointe de la racine14 (indiquée par des boîtes rouges à la figure1), ces régions ont été priorisées pour l'imagerie plutôt que pour l'imagerie de la racine complète. Longueurs. Dans les images lumineuses de P. simiae-colonized A. thaliana roots (Figure 2), il est possible de visualiser le contour des racines et des poils des racines; cependant, à 18 h de la colonisation, il n'est pas possible de différencier clairement les racines colonisées par rapport aux racines non colonisées à l'aide d'images lumineuses. Alors que P. simiae affiche l'autofluorescence, nous avons utilisé une souche également conçue pour exprimer une protéine fluorescente jaune (YFP)19 avec des longueurs d'onde d'excitation/émission de 490-510/520-550 nm18. Un grossissement de 100x était suffisant pour identifier clairement les agrégats individuels et petits des cellules de P. simiae sur des racines de A. thaliana. Comme le montre la figure 2, les laboratoires ayant accès à des microscopes confocalà haute résolution ou à des microscopes de banc moins coûteux peuvent à la fois visualiser la présence et la distribution de bactéries le long de la racine.
Bien qu'informatives en termes de distribution spatiale, les images de microscopie ne sont pas bien adaptées à la quantification des cellules bactériennes. Nous avons ainsi recueilli des bactéries de la surface des racines en utilisant l'ultrasonation comme précédemment décrit et validé9,20. Trois séries de 12 s d'ultrasonation21 à une amplitude de 40 ont été suffisantes pour perturber la surface externe des semis de racine (Figure supplémentaire 1) et éliminer toutes les bactéries tout en n'ayant pas d'impact sur la viabilité bactérienne. La sonication a été utilisée plutôt que des méthodes de perlation-battant9 pour mieux favoriser la dispersion des agrégats bactériens/biofilms. La quantification de l'UFC/racine après 18 h de colonisation et 72 h d'entretien supplémentaire a montré que P. simiae colonise et est maintenu sur les racines de A. thaliana dans notre système hydroponique de semis flottants (figure 3). Le nombre de CFU/seedling à chaque point de temps a montré une bonne reproductibilité à travers les répliques biologiques effectuées à différents jours (figure 3). La variation observée est fréquente parmi les essais de colonisation des racines22 et est probablement due à des variations mineures de la synchronisation, des conditions environnementales ou de la taille des racines des plantes, même parmi les semis germés en même temps et sélectionnés pour être de taille similaire. Nous observons une augmentation du nombre de CFU/semis après 72 h dans le milieu d'entretien par rapport aux nombres observés au point de temps post-colonisation de 18 h (figure 3). Ceci indique la croissance active des bactéries colonisées sur la racine de la plante s'est produite pendant l'étape d'entretien.
En plus de l'utilité de cet essais hydroponique pour quantifier la colonisation et l'entretien bactériens individuels, il est également applicable à la surveillance de l'association de plusieurs espèces sur les racines des plantes. Pour le démontrer, trois espèces de bactéries isolées de A. thaliana cultivées dans un sol naturel dans des conditions de laboratoire ont été choisies20. Les isolats étaient des souches d'Arthrobacter nicotinovorans, Microbacterium oleivorans, et Curtobacterium oceanosedimentum23. Cette communauté simplifiée a été choisie en raison de la capacité de ces espèces à coexister dans les milieuis bactériens liquides dans la culture de secousses (données non publiées). En outre, ces trois espèces peuvent être clairement différenciées sur les médias contenant X-gal en raison des différences dans la morphologie et la couleur des colonies (Figure 4A). La fille X n'affecte pas la croissance relative de l'une ou l'autre de ces espèces bactériennes (données non publiées). Ces différences dans la morphologie et l'apparence des colonies sur X-gal nous ont permis de compter le CFU/seedling de chaque espèce sans sélection d'antibiotiques, même dans la coculture multi-espèces.
A. nicotinovorans, M. oleivorans et C. oceanosedimentum ont tous été colonisés et maintenus sur la racine, que ce soit seul ou en coculture bactérienne (figure 4B). Chaque espèce a montré des tendances qui étaient similaires selon les différentes répliques biologiques et techniques, même au sein des communautés mixtes. Cela démontre que le protocole d'analyse peut être utilisé pour mesurer à la fois la CFU/racine relative ou totale de chaque espèce. Fait intéressant, lorsqu'elles sont cultivées seules, aucune espèce individuelle n'a montré une augmentation appréciable de l'abondance au cours de la phase d'entretien, mais l'ensemble de l'UFC/racine de la communauté combinée a augmenté dans les cocultures, ce qui indique que ces bactéries n'interdisent pas la colonisation des autres souches.
Pour toutes les expériences, les plantes cultivées dans des supports liquides sans l'ajout de bactéries comme contrôles négatifs ont toujours été inclus. Aucune bactérie n'a été visible sur ces racines témoins pendant la microscopie (figure 2), et aucune bactérie n'a été détectée par placage pour l'UFC (données non publiées). Ceci indique que la stérilisation des graines et l'utilisation des techniques stériles pendant cet arrêt étaient suffisantes pour maintenir les plantes hachenic à moins que délibérément colonisé.
Figure 1 : Mise en service pour la colonisation bactérienne et l'entretien des racines a. thaliana. Les semis a. thaliana cultivés sur des mailles de plastique stérilisées ont été transférés à un milieu de croissance optimisé pour les bactéries [ici, 0,1 x LB (Luria Broth) Lennox]. Les bactéries ont ensuite colonisé la racine à plus de 18 h tandis que la plante flottait dans le liquide secouant. Après un rinçant, le flotteur colonisé a été transféré à un milieu de croissance optimisé pour les plantes (0,5x MS et MES) pendant 72 h pour tester l'entretien des bactéries sur les racines. Le flotteur a ensuite été rincé, et la plante avec des microbes attachés a été enlevée pour analyse (quantification de cFU/seedling ou imagerie par microscopie). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Visualisation de la colonisation des racines par P. simiae à l'aide d'une microscopie fluorescente. P. simiae (vert de fausse couleur) a colonisé les racines A. thaliana et a été maintenue sur la racine après le transfert vers le milieu de croissance végétale. La couronne de racine (gauche), la longueur moyenne (au centre) et la pointe (à droite) à 40x grossissement sont indiquées à partir des zones indiquées à la figure 1. Les deux premières rangées montrent les images lumineuses et fluorescentes des racines colonisées par P. simiae (image par microscopie épifluorescente). Les mêmes racines ont également été représentées par un microscope confocal (centre de deux rangées). Le contrôle négatif sans bactéries dans les deux rangées inférieures n'a montré aucune colonisation. Les barres d'échelle représentent 50 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Quantification de P. simiae sur les racines de A. thaliana. Nombre total de cellules viables de P. simiae récupérées par semis de A. thaliana après 18 h de colonisation ou 72 h d'entretien. Trois répliques biologiques individuelles sont montrées, chacune contenant trois répliques techniques de deux semis par flotteur. Les nombres indiqués sont les moyens des répliques techniques, tandis que les barres représentent des erreurs standard des moyens. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Quantification de la colonisation et du maintien d'une communauté bactérienne mixte sur les racines de A. thaliana. (A) Les colonies de A. nicotinovorans, de M. oleivorans et de C. oceanosedimentum peuvent être différenciées sur le milieu d'agar contenant des X-gal par morphologie et couleur de colonie. (B) Les racines de 10 semis d'un jour ont été inoculées avec environ 3x105 CFU/mL de chacune des trois souches. On montre le total de l'UFC/semis récupéré sa part après 18 h de colonisation ou 72 h d'entretien lorsqu'il est colonisé seul ou dans une communauté bactérienne de trois membres. Deux répliques biologiques, chacune comprenant deux répliques techniques de deux semis par flotteur, sont présentées. Les chiffres indiqués sont les moyens des deux répliques techniques, tandis que les barres représentent des erreurs standard des moyens. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire 1 : L'ultrasonionnement perturbe la surface de la racine. Pour déloger les bactéries de la surface de la racine, des plantes entières ont été sonicated, et les bactéries ont été libérées dans le liquide, qui a été en série dilué et plaqué pour la quantification de CFU/seedling. (A) Un semis intact est (B) structurellement perturbé après ultrasonation. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Les plantes dans tous les environnements interagissent avec des milliers à des millions de bactéries et de champignons différents5,7. Ces interactions peuvent avoir un impact négatif et positif sur la santé des plantes, avec des effets potentiels sur le rendement des cultures et la production alimentaire. Des travaux récents suggèrent également que la colonisation variable des cultures par les PGPB peut expliquer la taille imprévisible des plantes et le rendement des cultures dans les essais sur le terrain22. Comprendre les mécanismes derrière ces interactions pourrait nous permettre de manipuler directement les communautés microbiennes associées aux plantes pour faciliter le développement sain des plantes, même sous l'effort24.
Parce que la colonisation bactérienne des racines et leur entretien dans la rhizosphère est essentiel pour les interactions plante-microbe9, nous voulions construire un système pour visualiser et quantifier de façon reproductible ces comportements bactériens. Ce système hydroponique de croissance flottante des semis permet l'imagerie microscopique et la quantification des populations bactériennes sur les racines de A. thaliana.
L'analyse d'interaction plante-microbe décrite intègre des éléments bénéfiques des protocoles expérimentaux existants. La méthode de maillage flottant était basée sur celle de Haney et coll.13, qui mesuraient la colonisation initiale de P. simiae WCS417r sur des semis a. thaliana flottants statiques. En évaluant ce système, la colonisation forte des racines d'A. thaliana par P. simiae a été validée, même si un milieu de croissance différent de Haney et autres a été utilisé et a inclus des secousses orbitales pendant la colonisation. L'inclusion de secousses orbitales pendant la colonisation et l'entretien facilite les interactions bactériennes qui pourraient ne pas se produire dans la culture statique, ainsi que de réduire les conditions anoxiques qui peuvent inhiber à la fois la croissance bactérienne et la santé des racines des plantes13. Nous avons également intégré des aspects des protocoles axés sur la microbiologie conçus pour soutenir la colonisation des racines végétales par diverses espèces bactériennes8,15,25. Il s'agissait notamment d'une étape cruciale de transfert hors du milieu optimisé pour la colonisation bactérienne et dans un milieu optimisé pour la croissance des plantes. Ce transfert vers un milieu frais permettra également de commencer à aborder les mécanismes sous-jacents à l'entretien bactérien des racines, une approche qui pourrait permettre de mieux comprendre le maintien erratique du PGPB dans les essais sur le terrain6.
Cet analyse a été optimisé pour le traitement rapide de plusieurs échantillons afin de permettre d'établir des variables environnementales et des communautés bactériennes mixtes dans une seule réplique biologique multi-puits. Tandis que l'ultrasonification a été précédemment montrée pour être suffisante pour la perturbation et la collecte des bactéries de rhizosphere, la plaque de 24 puits et la fixation de corne multi-prong accélère le traitement d'échantillon. Cette approche de calcul de la viabilité cellulaire pour quantifier la présence bactérienne pourrait être complétée ou élargie pour inclure le profilage de la communauté génétique qPCR ou MiSeq 16S rRNA afin de déterminer l'abondance relative de communautés plus diversifiées de bactéries colonisatrices. 20. En outre, pendant l'imagerie, l'utilité de se concentrer sur seulement trois régions de chaque racine végétale pour accélérer la visualisation de la présence bactérienne et la localisation sur les racines est mise en évidence. La colonisation de ces différentes régions racinaires a été montrée pour différer parmi les espèces bactériennes14. L'imagerie peut être réalisée avec des bactéries naturellement autofluorescentes ou des bactéries génétiquement traitables conçues pour exprimer une protéine fluorescente.
La méthodologie décrite ici permet une évaluation rapide et reproductible de la colonisation des racines par les bactéries PGPB, mais il y a des limites aux conclusions qui peuvent être tirées de ces expériences. Par exemple, la capacité des bactéries à chimiotax vers la racine est connue pour être importante pour la colonisation de nombreuses espèces bactériennes des racines des plantes, mais ce processus peut ne pas être nécessaire dans ce système d'inoculation secouant. Cela dit, pour les études spécifiquement intéressées par la chimiotaxie, l'étape de colonisation pourrait être effectuée dans la culture liquide statique ou à la surface d'un milieu d'agar mou, où les bactéries pourraient être plaquées loin de la plante, les obligeant à se déplacer activement vers le racine. En outre, un milieu de croissance relativement riche pendant la colonisation a été utilisé pour favoriser la croissance bactérienne et l'attachement des plantes; cependant, ces concentrations relativement élevées d'éléments nutritifs peuvent interdire l'examen de l'utilisation bactérienne ou de la concurrence pour le carbone d'origine végétale pendant la colonisation. Encore une fois, selon les besoins de croissance des bactéries étudiées, le milieu de colonisation peut être varié pour mieux répondre aux questions de recherche particulières de chercheurs spécifiques.
Ce système a été conçu pour être facilement adapté à différentes conditions de croissance bactérienne et végétale et à l'ajout de différents facteurs de stress et de points de temps environnementaux. Cependant, les méthodes décrites ici sont les mieux adaptées pour mesurer les interactions bactériennes avec les racines des semis de A. thaliana. La collecte a été optimisée pour cette usine, et les plantes plus grandes ou plus sensibles peuvent être insolubles dans le système flottant à plaques multiples. Enfin, tandis que les bactéries d'intérêt utilisées ici coloniser la racine de la plante dans la culture liquide, pour d'autres bactéries, il peut être nécessaire d'inoculer les racines des plantes par trempette ou le placage sur un milieu d'agar solide au lieu19.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ces travaux ont été appuyés par des fonds de recherche fournis par le Département de la recherche biologique et environnementale de l'énergie (DOE-BER 0000217519 à E.A.S.), la National Science Foundation (INSPIRE IOS-1343020 à E.A.S). SLH a également reçu l'appui du Programme de bourses d'études supérieures de la National Science Foundation. Nous remercions le Dr Jeffery Dangl d'avoir fourni des souches bactériennes et des renseignements inestimables. Nous remercions le Dr Andrew Klein et Matthew J. Powers pour leurs suggestions expérimentales. Enfin, SLH tient à remercier les réseaux sociaux de nous rappeler que la diffusion de la science est un privilège et une responsabilité, notamment par des moyens créatifs et accessibles.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Required Materials | |||
| 1.5 mL eppendorf tubes | any | N/A | |
| 24-well plates | BD Falcon | 1801343 | |
| Aeraseal | Excel Scientific | BE255A2 | |
| Autoclave | any | N/A | |
| Bacteria of Interest | any | N/A | Stored at -80?C in 40% glycerol preferred |
| BactoAgar | BD | 2306428; REF 214010 | |
| bleach | any | N/A | |
| Conviron | any | N/A | Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21?C, with inner power outlet |
| Dessicator Jar: glass or heavy plastic | any | N/A | |
| Ethanol | any | N/A | |
| Flame | any | N/A | |
| Forceps | any | N/A | |
| Incubator | any | N/A | At optimal temperature for growth of specified bacteria |
| Hydrochloric Acid | any | N/A | |
| Lennox LB Broth | RPI | L24066-1000.0 | |
| Microcentrifuge | any | N/A | |
| Micropipetters | any | N/A | Volumes 5 µL to 1000 µL |
| Microscope (preferably fluorescence) | any | N/A | Could be light if best definition not important |
| MS Salts + MES | RPI | M70300-50.0 | |
| Orbital Plate Shaker | any | N/A | Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours |
| Petri Dishes | any | N/A | 50 mL total volume |
| Reservoirs | any | N/A | |
| Spectrophotometer | any | N/A | |
| Standard Hole Punch | any | N/A | Approximately 7mm punch diameter |
| Sterile water | any | N/A | |
| Surgical Tape | 3M | MMM1538-1 | |
| Teflon Mesh | McMaster-Carr | 1100t41 | |
| Ultrasonicator | any | N/A | |
| Vortex Mixer | any | N/A | |
| X-gal | GoldBio | x4281c | other vendors available |
| Suggested Materials | |||
| 24 Prong Ultrasonicator attachment | any | N/A | For sonicating multiple samples at once. Can be done individually |
| Alumaseal II | Excel Scientific | FE124F | |
| Glass beads | any | N/A | |
| Multipetter/Repetter | any | N/A | |
| Sterile 96-well plates | any | N/A | For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes |
| Biological Materials Used | |||
| Arabidopsis thaliana seeds | any | N/A | We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks |
| Arthrobacter nicotinovorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Curtobacterium oceanosedimentum | Levy, et al. 2018 | ||
| Microbacterium oleivorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Pseudomonas simiae WCS417r | Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017 |
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