Summary
Hier beschreiben wir einen hydroponischen Pflanzenwachstumstest zur Quantifizierung des Artenvorkommens und zur Visualisierung der räumlichen Verteilung von Bakterien während der anfänglichen Besiedlung von Pflanzenwurzeln und nach deren Übertragung in verschiedene Wachstumsumgebungen.
Abstract
Bakterien bilden komplexe Rhizosphären-Mikrobiome, die durch interagierende Mikroben, größere Organismen und die abiotische Umgebung geformt werden. Unter Laborbedingungen kann die Besiedlung der Rhizosphäre durch pflanzenwachstumsfördernde Bakterien (PGPB) die Gesundheit oder die Entwicklung von Wirtspflanzen im Vergleich zu nicht kolonisierten Pflanzen erhöhen. In Feldumgebungen bieten bakterielle Behandlungen mit PGPB jedoch oft keine wesentlichen Vorteile für Die Kulturen. Eine Erklärung ist, dass dies auf den Verlust der PGPB während der Wechselwirkungen mit endogenen Bodenmikroben über die Lebensdauer der Pflanze zurückzuführen sein kann. Diese Möglichkeit war schwer zu bestätigen, da sich die meisten Studien auf die anfängliche Kolonisierung konzentrieren und nicht auf die Aufrechterhaltung von PGPB innerhalb von Rhizosphärengemeinschaften. Es wird hier vermutet, dass die Montage, Koexistenz und Aufrechterhaltung von Bakteriengemeinschaften durch deterministische Merkmale der Rhizosphäre Mikroumgebung geformt sind, und dass diese Wechselwirkungen das ÜBERLEBEN von PGPB in nativen Umgebungen beeinflussen können. Um diese Verhaltensweisen zu untersuchen, wird ein hydroponischer Pflanzenwachstumstest mit Arabidopsis thaliana optimiert, um die räumliche Verteilung von Bakterien während der anfänglichen Besiedlung von Pflanzenwurzeln und nach der Übertragung auf verschiedene Wachstumsergebnisse zu quantifizieren und zu visualisieren. Umgebungen. Die Reproduzierbarkeit und nützlichkeit dieses Systems werden dann mit dem gut untersuchten PGPB Pseudomonas simiaevalidiert. Um zu untersuchen, wie das Vorhandensein mehrerer Bakterienarten die Besiedlungs- und Erhaltungsdynamik auf der Pflanzenwurzel beeinflussen kann, eine Modellgemeinschaft aus drei Bakterienstämmen (ein Arthrobacter, Curtobacteriumund Microbacterium Ursprünglich aus der A. thaliana Rhizosphäre isoliert, ist konstruiert. Es wird gezeigt, dass das Vorhandensein dieser verschiedenen Bakterienarten mit diesem hydroponischen Pflanzen-Maintanence-Assay gemessen werden kann, der eine Alternative zu Sequenzierungsbasierten bakteriellen Gemeinschaftsstudien bietet. Zukünftige Studien mit diesem System können das Verständnis des bakteriellen Verhaltens in Mehrarten-Pflanzenmikrobiomen im Laufe der Zeit und in sich verändernden Umweltbedingungen verbessern.
Introduction
Die Zerstörung von Pflanzen durch bakterielle und Pilzkrankheiten führt zu einer geringeren Nahrungsmittelproduktion und kann die globale Stabilität stark stören1. Basierend auf der Entdeckung, dass Mikroben in unterdrückenden Böden für die Erhöhung der Pflanzengesundheit verantwortlich sind2, haben Wissenschaftler gefragt, ob das Pflanzenmikrobiom genutzt werden kann, um das Pflanzenwachstum zu unterstützen, indem das Vorhandensein und die Fülle bestimmter Bakterienarten3. Bakterien, die beim Pflanzenwachstum oder bei der Entwicklung helfen, werden kollektiv als pflanzenwachstumsfördernde Bakterien (PGPB) bezeichnet. In jüngerer Zeit haben sich Studien von der einfachen Identifizierung potenzieller PGPB zu dem Verständnis verschoben, wie Interkingdom-Wechselwirkungen im Boden, um Wurzeln oder in der Rhizosphäre (das Gebiet, das direkt um die Wurzeloberfläche liegt) DIE PGPB beeinflussen können. Aktivität4.
Rhizosphäre Kolonisation durch PGPB kann die Gesundheit oder die Entwicklung von Wirtspflanzen als Reaktion auf verschiedene Stressoren im Vergleich zu unkolonisierten Pflanzenerhöhen 5. Allerdings sind die Ergebnisse bei einheimischen Bodenverhältnissen oft variabler als in den eng kontrollierten Gewächshäusern und Laborumgebungen6. Eine Hypothese für diesen Unterschied ist, dass das Wachstum oder Verhalten von PGPB durch einheimische Bodenbakterien oder Pilze in den Feldern7,8gehemmt werden kann. Günstige Effekte von RhizosphäreBakterien hängen in der Regel von der Fähigkeit der Bakterien ab, 1) zu lokalisieren und sich in Richtung der Wurzel zu bewegen, 2) die Wurzel durch Biofilmbildung zu besiedeln und 3) mit der Wirtspflanze oder Krankheitserregern über die Produktion kleiner Moleküle zu interagieren Metaboliten7,9. Jedes dieser Kolonisierungsverhalten kann durch das Vorhandensein und die Aktivität benachbarter Mikroben beeinflusst werden10.
Wir haben ein System entwickelt, um diese ausgeprägten bakteriellen Besiedlungsstadien der Rhizosphäre zu quantifizieren und zu visualisieren (Abbildung 1). Dieser Ansatz wird Studien erleichtern, die untersuchen, warum die langfristige PGPB-Wartung nach der Übertragung von Pflanzen in neue Umgebungen, wie z. B. bei der Anpflanzung von vorgeimpften Sämlingen, manchmal nicht beobachtet wird. Arabidopsis thaliana als Pflanzenmodell aufgrund seiner umfangreichen Verwendung in Laborstudien sowie der umfangreichen verfügbaren Daten über seine mikrobiellen Wechselwirkungen11. Es gibt drei Stufen im System: 1) A. thaliana Wachstum, 2) bakterielle Besiedlung und 3) bakterielle Erhaltung (siehe Abbildung 1). Da A. thaliana eine terrestrische Pflanze ist, war es wichtig sicherzustellen, dass sie nicht übermäßigen Wasserstress im hydroponischen System erlitt12. Inspiriert von den Methoden von Haney et al.13,werden die Sämlinge auf Kunststoffgitter numeriert, um den Trieb vom flüssigen Wachstumsmedium zu trennen. Dieses System scheint die Gesundheit und Entwicklung des Pflanzenwirts nicht zu beeinträchtigen, und es verbessert das A. thaliana Wachstum in flüssigen11. Während der Pflanzentrieb über der Oberfläche schwebt, werden die Wurzeln vollständig der Besiedlung durch Bakterien ausgesetzt, die in das flüssige bakterielle Wachstumsmedium eingeimpft werden. Dies ermöglicht es Bakterien von Interesse auf die Besiedlung in Nährstoffen untersucht werden, die am meisten förderlich für das Wachstum sind, während dann die Bedingungen verschieben, damit die Pflanze weiterhin in einem Nährstoffmedium wachsen, das entwickelt wurde, um sein Wachstum zu unterstützen. Beide Stadien beinhalten stetiges Schütteln, um Anoxie der Wurzel13zu verhindern. Bakterien können aus den Pflanzenwurzeln nach dem Transfer aus dem Besiedlungsmedium oder dem Pflegemedium visualisiert oder quantifiziert werden. Dieses hydroponische System ist sehr flexibel, so dass experimentelle Bedingungen und angewandte Spannungen je nach Interessen der Forscher leicht verändert werden können.
Diese beschriebene Methode ist im Kontext des größeren Literaturkörpers über Pflanzen-Mikroben-Wechselwirkungen wichtig, da sie ein robustes System zur Untersuchung dieser Wechselwirkungen an der Wurzeloberfläche bietet und gleichzeitig an die Wachstumspräferenzen von verschiedenen Bakterien. Pflanzenbiologie-Labore führen oft Pflanzen-Mikroben-Kolonisationsexperimente an festen Agarn durch, sodass nur eine planare Bewegung (wenn dies) von Bakterien möglich ist, während gleichzeitig die potenziell destruktive Manipulation von Pflanzen während der späteren Übertragung erforderlich ist. Im Gegensatz dazu haben mikrobiologische Labore häufig die Gesundheit der Bakterien in ihren Experimenten priorisiert, zum Nachteil der Pflanzen14,15. Diese unterschiedlichen Prioritäten pflanzen- und mikrobiologischer Labore haben es in der Vergangenheit schwierig gemacht, die Ergebnisse zwischen diesen Gruppen zu vergleichen, da jede in der Regel experimentelle Bedingungen optimiert, um ihren Organismus von Interesse zu optimieren15. Das hier beschriebene Floating-Mesh-Pflanzen-Wachstumssystem verhindert das vollständige Eintauchen von Pflanzen, ein bemerkenswerter Vorteil früherer mikrobiologisch-orientierter Studien, während gleichzeitig das Wachstum und Überleben von Bakterien vorübergehend optimiert wird, um die Kolonisation zu erleichtern. So kann der Test, den wir hier vorstellen, Bedenken sowohl von Pflanzenbiologen (über Überfeuchtung und taktile Manipulation der Pflanze) als auch die Erfüllung der Kriterien von Mikrobiologen (die unterschiedliche bakterielle Wachstumsbedingungen und mehrere Wechselwirkungen der Arten)7. Dieses Protokoll ist so konzipiert, dass es für den Einsatz mit verschiedenen Bakterien, Pflanzen und Umweltbedingungen anpassungsfähig ist.
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Protocol
HINWEIS: Der Versuchsaufbau wird aus Gründen der Übersichtlichkeit beschrieben und verwendet, um die repräsentativen Ergebnisse in diesem Bericht zu generieren, aber die Bedingungen können nach Belieben geändert werden. Alle Schritte sollten mit PSA und folgenden institutionellen und föderalen Rückforderungen für die Sicherheit durchgeführt werden, entsprechend dem BSL-Status der verwendeten Bakterien.
1. Charakterisierung von Bakterien
- Bestimmen Sie die Morphologie von Bakterien auf dem Wachstumsmedium Agarplatte. Resuspend Zellen bei einem ungefähren OD600 = 0,5 und Platte ein 1 L Volumen auf Agar Medium der Wahl. Fügen Sie X-gal zu Agar-Platten zu einer Endkonzentration von 20 mg/ml hinzu, um einzelne Mitglieder der spezifischen Bakteriengemeinschaft besser zu unterscheiden. Wachsen Sie bei 24 °C oder 30 °C, bis sich Kolonien bilden, und machen Sie dann Fotos und Notizen zur Koloniemorphologie.
- Definieren Sie die Korrelation zwischen der optischen Dichte jedes Bakterienstamms und der Anzahl der KBE (Koloniebildeinheiten) pro ml16. Resuspend Bakterien in 1 ml Wasser in einer 24-Well-Platte auf eine ungefähre OD600 = 5, führen sie zweifach serielle Verdünnungen durch, überwachen OD600 aller Verdünnungen und platten jeweils die lebensfähige KBE/ml in jeder Probe bei mehreren optischen Dichten.
- Bestimmen Sie die maximale Beschallungstoleranz für jeden Bakterienstamm. Dazu werden Zellen in eine 24-Well-Platte mit flüssigem Medium eingebracht, die einige Zellen als unbeschallte Kontrollprobe vorbehält. Mit einem Ultraschallgerät mit 24-Spitzen-Hornaufsatz, wenden Sie drei Runden von 12 s Beschallung bei 40 Ampere mit 2 s Impulsen.
HINWEIS: Die Verwendung eines 24-Well-Ultraschallgerätes wird empfohlen, um das nachgeschaltete Multiplexing von Verarbeitungsanlagenproben zu erleichtern, aber wenn einer nicht verfügbar ist, verwenden Sie einen Ultraschallgerät, der mit einer Mikrospitze ausgestattet ist, und führen Sie jede Probenbeschallung unabhängig durch. Tragen Sie immer Ohrenschützer mit einem Nennwert von mindestens 25 NRR-Schutz. - Führen Sie 10-fache serielle Verdünnungen der beschallten und unbeschallten Proben durch und erkennen Sie auf Agarplatten. Bestimmen Sie, ob es eine Verringerung der lebensfähigen Zellen nach der Beschallung gibt. Wenn ja, verwenden Sie einen frischen Proben- und wiederholten Beschallungsschritt mit einer reduzierten Gesamtbeschallungszeit oder Amplitude, bis die Behandlung keine Auswirkungen auf die endgültige CFU/mL17hat.
2. Herstellung von Arabidopsis thaliana Sämlingen auf einem Kunststoffgitter
- Erstellen Sie Scheiben des Kunststoffgewebes mit einem Standardlochstanzer.
- Sammeln Sie die Scheiben in einem Glasbehälter mit einer lockeren Abdeckung aus Aluminiumfolie, und sterilisieren Sie mit einem Autoklaven auf einen 20 min Trockenzykluseingestellt 13.
- Verteilen Sie mit einer flammensterilisierten Pinzette ca. 40 sterilisierte Netzscheiben in einer einzigen Schicht über die Oberfläche einer pflanzenwachstumsmittleren Agarplatte. Verwenden Sie 0,5x Murashige- und Skoog-Salze (MS), die 500 mg/L MES-Puffer [2-(N-Morpholino)Ethansulfonsäure] und 1,5 % Bacto-Agar als Pflanzenwachstumsmedium enthalten, wobei 50 g/ml Benomyl der Grenze der Pilzkontamination der Sämlinge zugesetzt werden.
- Bereiten Sie axtische Samen von A. thaliana wie zuvor beschrieben17.
- Legen Sie jeweils ca. 100–300 Samen in einzelne Zentrifugenrohre in ein Rack und legen Sie sie in einen wiederverschließbaren Glas- oder schweren Kunststoffbehälter ("Jar") in eine Dunstabzugshaube.
- Mit Vorsicht, legen Sie einen Becher von 100 ml Bleichmittel in das Glas, fügen Sie 3 ml konzentrierte HCl auf die Bleichmittel, und sofort versiegeln Sie das Glas und lassen Sie Dämpfe Samen für mindestens 4 h sterilisieren.
- Entfernen Sie vorsichtig die Schläuche von sterilisierten Samen unter dem Glas und versiegeln.
- Legen Sie zwei Samen in die Mitte jedes Netzes. Platten mit chirurgischem Klebeband versiegeln und 2–6 Tage bei 4 °C in der Dunkelheit bebrüten, um Samen zu vernalisieren.
- Um Sämlinge zu keimen und anzubauen, legen Sie die Platte Agarseite in einer Pflanzenwachstumskammer für 8–10 Tage unter kurzen Tageseinstellungen: 9 h Licht bei 21 °C und 15 h Dunkel bei 18 °C (Abbildung1, Schritt 2).
3. Kolonisierung von Pflanzen in flüssigem bakteriellem Wachstumsmedium
- Fügen Sie 1 ml bakterielles Wachstumsmedium zu jedem Brunnen einer sterilen 24-Well-Platte hinzu, mit Ausnahme von reinen Medienkontrollbrunnen. Verwenden Sie Lennox Luria Broth (10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl) als bakterielles Wachstumsmedium.
- Übertragen Sie die in Mesh eingebetteten keimten Sämlinge von Agarplatten in die Flüssigkeit (Abbildung1, Schritt 3a).
- Schälen Sie das Netz mit zwei gekeimten Sämlingen vorsichtig mit flammensterilisierten Zangen auf und von der Agarplatte. Wählen Sie Mesh mit gleich großen und unbeschädigten Sämlingen.
- Wenn das Entfernen aus dem Agar nicht glatt ist, entsorgen Sie dieses Netz und die Pflanze. Übertragen Sie einen Schwimmer auf jede Bohrung von bakteriellen Wachstum Flüssigkeit, Wurzelseite nach unten.
- Inokulieren Sie Bakterien in Brunnen, die schwimmende Sämlinge enthalten.
- Resuspend Bakterien wachsen über Nacht auf Agar-Platten zu einem OD600 entspricht 108 KBE/ml in der bakteriellen Wachstumsmedium Flüssigkeit. Fügen Sie jedem Brunnen 10 l bakterielle Suspension für eine Endkonzentration von 106 KBE-Bakterien pro Brunnen hinzu.
- Wenn Sie eine Mischung von Bakterien vorbereiten, setzen Sie jede auf die OD600 entsprechend 108 KBE/ml, mischen Sie in gleichen Anteilen, und fügen Sie 10 l der endlichen Mischung pro Bohrgut Flüssigkeit hinzu.
- Versiegeln Sie die Platte für steriles Wachstum. Ohne die klebrige Seite zu berühren, drücken Sie vorsichtig den gasdurchlässigen Film über die Platte. Stellen Sie sicher, dass jeder Brunnen einzeln versiegelt wurde, indem Sie Druck um jeden der Ringe ausüben, die von den Brunnen gemacht werden. Ersetzen Sie den Kunststoffdeckel der Platte kuschelig über der Platte und der gasdurchlässigen Folie (Abbildung1, Schritt 3b).
- Inkubieren Sie die Platten für 18 h in einer Pflanzenwachstumskammer, unter den gleichen Bedingungen wie die Sämlinge ursprünglich gekeimt wurden, außer auf einem Orbitalplatten-Shaker auf 220 U/min eingestellt.
4. Aufrechterhaltung der bakteriellen Besiedlung
- Um alle Schwimmer (Pflanzen auf Mesh) zu spülen, fügen Sie 1 ml steriles Wasser in die Brunnen einer neuen 24-Well-Platte. Gasdurchlässige Folie entfernen. Mit sterilen Zangen, übertragen Schwimmer zu Brunnen mit Wasser (Abbildung1, Schritt 4a). Spülen Sie durch Ausruhen für 10 min bei Raumtemperatur (RT) ohne Rührung.
HINWEIS: Um die bakterielle Besiedlungseffizienz der Wurzeln zu bestimmen, anstatt ihre Fähigkeit, die Besiedlung im Laufe der Zeit aufrechtzuerhalten, können Pflanzen in diesem Schritt geopfert werden, indem sie direkt zu Schritt 5.1 gebracht werden. - Füllen Sie die Brunnen einer neuen 24-Well-Platte mit 1 ml Pflanzenwachstumsmedium. Übertragen Sie ein Netz auf jeden Brunnen. Mit einer gasdurchlässigen Dichtung abdecken und 72 h auf dem Orbitalplatten-Shaker bei 220 Umdrehungen pro Minute in der Pflanzenwachstumskammer inkubieren (Abbildung1, Schritt 4b).
- Wiederholen Sie die Spülung wie in Schritt 4.1 mit Schwimmern nach der 72 h Inkubationszeit.
5. Sammlung von Bakterien für lebensfähige Zellzahl
HINWEIS: Die Anzahl der Bakterien pro Sämlingswurzel kann zu jedem Inkubationszeitpunkt bestimmt werden. Die Kolonisation kann zwischen 0 h und 18 h überwacht werden, während die Wartung ab 18 h überwacht werden kann. Pflanzen, die für die Bildgebung bestimmt sind, können direkt zu Abschnitt 6 übergehen.
- Entfernen Sie die Sämlinge aus dem Netz (Abbildung1, Schritt 5). Legen Sie die flammensterilisierten Zangen vorsichtig unter die Blätter (aber auf der Blattseite des Netzes), und kneifen Sie den Stiel leicht. Wiggle die Sämlinge auf und weg aus dem Netz, um die Wurzel zu vertreiben, ohne sie zu brechen. Wenn die Wurzel bricht, kratzen Sie vorsichtig den Netzboden, um die volle Länge zu sammeln.
- Entfernen Sie Bakterien von Pflanzenwurzeln. Übertragen Sie die Bakterien in die Brunnen einer 24-Well-Platte, die 1 ml ddH20 enthält. Sonicate die Proben wie in Schritt 1.3 beschrieben.
HINWEIS: Suchen Sie mit einem Mikroskop nach verbleibenden Bakterien auf der Wurzeloberfläche auf einer beschallten Probe. Wenn Bakterien bleiben, erhöhen Sie die gesamte Beschallungszeit oder -intensität, bis keine Bakterien gebunden bleiben, bis zu dem höchsten Grad der Beschallung, die nicht lebensfähige Zellzahl beeinflusst, wie in Abschnitt 1 bestimmt. - Quantifizieren Sie die Bakterien an den Wurzeln.
- Führen Sie serielle 10-fache Verdünnungen der beschallten Proben bis zu einer Verdünnung von 10-6 im bakteriellen Wachstumsmedium durch. Fügen Sie 50 l jeder Verdünnung zu einzelnen Agarplatten hinzu und verteilen Sie sie mit sterilen Glasperlen (oder bakteriellem Streuer). Inkubieren Sie Platten bei der optimalen Temperatur für Bakterien, bis einzelne Kolonien zählbar sind.
- Zählen Sie einmal die Anzahl jeder Koloniemorphologie (wie in Abschnitt 1 bestimmt) und berechnen Sie die KBE jeder Bakterienart pro Sämling. Entsorgen Sie alle Proben, die eine Kontamination aufweisen, da eine Kontamination während der Besiedlung oder Wartung das Vorhandensein von Bakterien beeinträchtigen kann.
6. Sammlung intakter Pflanzenwurzeln für die Mikroskopie
- Entfernen Sie die Sämlinge mit Zangen aus dem Netz wie in Abschnitt 5.
- Übertragen Sie jede Pflanze auf Mikroskopschlitten.
- Legen Sie die Spitze der Wurzel auf die Folie und ziehen Sie von der Spitze weg, um den Shoot bündig mit der Folie zu setzen, um eine begradigte Wurzel für beste Bildgebung zu gewährleisten. Fügen Sie den Proben einen Tropfen Wasser oder ein steriles Pflanzenwachstumsmedium hinzu, um die Schnittstellen zwischen den Abdeckungen und Dias zu hydratisieren.
- Legen Sie einen Glasdeckel knapp über der Wurzelkrone (oberste Boxregion in Abbildung 1) und unter die Triebblätter, um eine Schräglage des Coverslips zu vermeiden (um eine Wurzelkronenbildgebung zu ermöglichen), und drücken Sie vorsichtig17nach unten.
- Bei Verwendung von fluoreszierenden Bakterien, Bild mit geeigneten Anregung / Emissionsfilter, um Bakterien voneinander und die Pflanzenwurzel18zu unterscheiden.
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Representative Results
Die gut charakterisierte PGPB P. simiae WCS417r ist dafür bekannt, die Wurzeln von A. thaliana in der hydroponischen Kultur zu besiedeln. Dieses natürlich fluoreszierende Bakterium kann leicht mit Hilfe der Mikroskopie an den Wurzeln von Sämlingen nach der Besiedlung visualisiert werden (Abbildung 2). Obwohl es möglich ist, die volle Länge der Wurzeln dieser A. thaliana Sämlinge (4-6 mm Länge) abzubilden, würde dies für viele Pflanzen eine unerschwingliche Zeit in Anspruch nehmen. Da die meisten Variationen zwischen Zeitpunkten und Bakterienarten durch Abbildung der Krone, Der Mitte und Spitze der Wurzel14 erfasst werden können (angezeigt durch rote Felder in Abbildung 1), wurden diese Regionen für die Bildgebung priorisiert, anstatt die vollständige Wurzel zu bildgebungsbilden. Längen. In den Hellfeldbildern von P. simiae-kolonisierte A. thaliana Wurzeln (Abbildung 2) ist es möglich, die Umrisse der Wurzeln und Wurzelhaare zu visualisieren; Bei 18 h Kolonisation ist es jedoch nicht möglich, kolonisierte und nicht kolonisierte Wurzeln mit Hellfeldbildern klar zu unterscheiden. Während P. simiae Autofluoreszenz zeigt, verwendeten wir einen Stamm, der auch entwickelt wurde, um ein gelbes fluoreszierendes Protein (YFP)19 mit Anregungs-/Emissionswellenlängen von 490-510/520-550 nm18auszudrücken. Eine Vergrößerung von 100x reichte aus, um einzelne und kleine Aggregate von P. simiae-Zellen auf A. thaliana-Wurzeln eindeutig zu identifizieren. Wie in Abbildung 2dargestellt, können Laboratorien mit Zugang zu hochauflösenden Konfokalmikroskopen oder kostengünstigeren Tischmikroskopen sowohl das Vorhandensein als auch die Verteilung von Bakterien entlang der Wurzel visualisieren.
Mikroskopiebilder sind zwar informativ in Bezug auf die räumliche Verteilung, eignen sich aber nicht gut für die Quantifizierung von Bakterienzellen. So sammelten wir Bakterien von der Wurzeloberfläche mit Ultraschall, wie zuvor beschrieben und validiert9,20. Drei Runden von 12 s Ultraschall21 bei einer Amplitude von 40 reichten aus, um die äußere Oberfläche der Wurzelsämlinge zu stören (Ergänzungsabbildung 1) und alle Bakterien zu entfernen, ohne die bakterielle Lebensfähigkeit zu beeinträchtigen. Die Beschallung wurde anstelle von Perlenschlagmethoden9 verwendet, um die Dispersion von bakteriellen Aggregaten/Biofilmen besser zu fördern. Die Quantifizierung der KBE/Wurzel nach 18 h Besiedlung und weiteren 72 h Wartung zeigte, dass P. simiae sowohl kolonisiert als auch auf den Wurzeln von A. thaliana in unserem hydroponischen, schwimmenden Sämlingsystem gehalten wird (Abbildung 3). Die Anzahl der KBE/Sämlinge zu beiden Zeitpunkten zeigte eine gute Reproduzierbarkeit über biologische Replikationen hinweg, die an verschiedenen Tagen durchgeführt wurden (Abbildung 3). Die beobachtete Variation ist häufig unter den Wurzelbesiedlungs-Assays22 und ist wahrscheinlich auf geringfügige Variationen des Timings, der Umgebungsbedingungen oder der Pflanzenwurzelgröße zurückzuführen, selbst bei Sämlingen, die gleichzeitig keimten und als ähnlich groß ausgewählt wurden. Wir beobachten einen Anstieg der Anzahl der KBE/Sämlinge nach 72 h im Pflegemedium im Vergleich zu den Zahlen, die bei der Postkolonialisierung 18 h Zeitpunkt beobachtet wurden (Abbildung 3). Dies deutet auf ein aktives Wachstum der kolonisierten Bakterien auf der Pflanzenwurzel während der Erhaltungsphase hin.
Neben dem Nutzen dieses hydroponischen Assays zur Quantifizierung der individuellen bakteriellen Besiedlung und Erhaltung ist es auch für die Überwachung der Assoziation mehrerer Arten auf Pflanzenwurzeln anwendbar. Um dies zu demonstrieren, wurden drei Arten von Bakterien aus A. thaliana isoliert in natürlichen Boden unter Laborbedingungen gewachsen gewählt20. Die Isolate waren Stämme von Arthrobacter nicotinovorans, Microbacterium oleivorans und Curtobacterium oceanosedimentum23. Diese vereinfachte Gemeinschaft wurde aufgrund der Fähigkeit dieser Arten gewählt, in flüssigen bakteriellen Wachstumsmedien in der Schüttelkultur nebeneinander zu existieren (unveröffentlichte Daten). Darüber hinaus können diese drei Arten auf Medien, die X-gal enthalten, aufgrund von Unterschieden in der Koloniemorphologie und Farbe deutlich unterschieden werden (Abbildung 4A). Das X-gal hat keinen Einfluss auf das relative Wachstum einer dieser Bakterienarten (unveröffentlichte Daten). Diese Unterschiede in der Morphologie und dem Aussehen der Kolonie auf X-gal ermöglichten es uns, die KBE/Sämlinge jeder Art ohne Antibiotikaauswahl zu zählen, selbst in der Mehrarten-Kokultur.
A. Nicotinovorane, M. oleivorans und C. oceanosedimentum wurden alle besiedelt und an der Wurzel gehalten, ob allein oder in bakterieller Kokultur (Abbildung 4B). Jede Art zeigte Trends, die in verschiedenen biologischen und technischen Repliken ähnlich waren, sogar innerhalb gemischter Gemeinschaften. Dies zeigt, dass das Assay-Protokoll verwendet werden kann, um sowohl relative als auch vollständige KBE/Wurzel jeder Art zu messen. Interessanterweise, wenn allein angebaut, keine einzelne Arten zeigten eine spürbare Zunahme der Fülle während der Erhaltungsphase, aber die gesamte KBE / Wurzel der kombinierten Gemeinschaft in Kokulturen erhöht, was darauf hindeutet, dass diese Bakterien nicht verbieten, die Kolonisierung der anderen Stämme.
Für alle Experimente wurden Pflanzen, die in flüssigen Medien ohne Zugabe von Bakterien als Negativkontrollen angebaut wurden, immer einbezogen. An diesen Kontrollwurzeln waren während der Mikroskopie keine Bakterien sichtbar (Abbildung 2), und es wurden auch keine Bakterien durch Beschichtung für Die KBE nachgewiesen (unveröffentlichte Daten). Dies deutet darauf hin, dass die Sterilisation von Samen und die Verwendung der sterilen Techniken während dieses Assays ausreichten, um Pflanzen axtisch zu halten, es sei denn absichtlich kolonisiert.
Abbildung 1: Assay zur bakteriellen Besiedlung und Erhaltung von A. thaliana-Wurzeln. A. Thaliana-Sämlinge, die auf sterilisiertem Kunststoffgewebe angebaut wurden, wurden auf ein für Bakterien optimiertes Wachstumsmedium übertragen [hier 0.1 x LB (Luria Broth) Lennox]. Bakterien besiedelten dann die Wurzel über 18 h, während die Pflanze in schütterflüssigkeit schwebte. Nach einer Spülung wurde der kolonisierte Schwimmer auf ein für Pflanzen optimiertes Wachstumsmedium (0,5x MS + MES) für 72 h übertragen, um die Erhaltung von Bakterien an den Wurzeln zu testen. Der Schwimmer wurde dann abgeführt, und die Pflanze mit allen angeschlossenen Mikroben wurde zur Analyse entfernt (Quantifizierung von KBE/Sämling oder Bildgebung durch Mikroskopie). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Visualisierung der P. simiae Besiedlung von Wurzeln mit fluoreszierender Mikroskopie. P. simiae (falsch gefärbtes Grün) kolonisierte A. thaliana-Wurzeln und wurde nach der Übertragung auf das Pflanzenwachstumsmedium an der Wurzel gehalten. Wurzelkrone (links), mittlere Länge (Mitte) und Spitze (rechts) bei 40-facher Vergrößerung werden aus den in Abbildung 1angegebenen Bereichen dargestellt. Die oberen beiden Reihen zeigen die hellfeld- und fluoreszierenden Bilder von Wurzeln, die von P. simiae besiedelt wurden (abgebildet durch epifluoreszierende Mikroskopie). Die gleichen Wurzeln wurden auch von einem konfokalen Mikroskop (Mitte zwei Reihen) abgebildet. Die no-bacteria negative Kontrolle in den beiden unteren Reihen zeigte keine Besiedlung. Maßstabsbalken stellen 50 m dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Quantifizierung von P. simiae auf A. thaliana Wurzeln. Gesamtanzahl der P. simiae lebensfähigen Zellen, die pro A. thaliana Sämling nach 18 h Besiedlung oder 72 h Pflege zurückgewonnen wurden. Es werden drei einzelne biologische Repliken gezeigt, die jeweils drei technische Nachbildungen von zwei Sämlingen pro Schwimmer enthalten. Die angezeigten Zahlen sind die Mittelwerte aus den technischen Replikationen, während Balken Standardfehler der Mittelwerte darstellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Quantifizierung der Besiedlung und Erhaltung einer gemischten Bakteriengemeinschaft auf A. thaliana-Wurzeln. (A) Kolonien von A. nicotinovorans, M. oleivorans und C. oceanosedimentum können auf X-gal-haltigem Agarmedium durch Koloniemorphologie und Farbe unterschieden werden. (B) Die Wurzeln von 10 Tage alten Sämlingen wurden mit ca. 3x105 KBE/ml jeder der drei Stämme geimpft. Gezeigt werden Gesamt-KBE/ Sämling von jeder Art nach 18 h Der Kolonisation oder 72 h der Wartung, wenn entweder allein oder in einer dreiköpfigen bakteriengemeinschaft kolonisiert. Gezeigt werden zwei biologische Nachbildungen, die jeweils zwei technische Nachbildungen von zwei Sämlingen pro Schwimmer umfassen. Die angezeigten Zahlen sind die Mittelwerte aus den beiden technischen Replikationen, während Balken Standardfehler der Mittelwerte darstellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Ultraschall stört die Wurzeloberfläche. Um Bakterien von der Wurzeloberfläche zu entfernen, wurden ganze Pflanzen beschallt und die Bakterien in die Flüssigkeit freigesetzt, die seriell verdünnt und zur Quantifizierung von KBE/Sämling plattiert wurde. (A) Ein intakter Sämling ist (B) nach Ultraschall strukturell gestört. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Pflanzen in allen Umgebungen interagieren mit Tausenden bis Millionen von verschiedenen Bakterien und Pilzen5,7. Diese Wechselwirkungen können sich entweder negativ und positiv auf die Pflanzengesundheit auswirken, mit möglichen Auswirkungen auf den Ernteertrag und die Nahrungsmittelproduktion. Jüngste Arbeiten deuten auch darauf hin, dass eine variable Besiedlung von Kulturen durch PGPBs für unvorhersehbare Pflanzengröße und Ernteerträge in Feldversuchen verantwortlich sein kann22. Das Verständnis der Mechanismen hinter diesen Wechselwirkungen könnte es uns ermöglichen, pflanzenassoziierte mikrobielle Gemeinschaften direkt zu manipulieren, um die Entwicklung gesunder Pflanzen zu unterstützen, selbst unter Stress24.
Da die bakterielle Besiedlung von Wurzeln und deren Erhaltung in der Rhizosphäre für Pflanzen-Mikroben-Wechselwirkungen9von entscheidender Bedeutung ist, wollten wir ein System aufbauen, um diese bakteriellen Verhaltensweisen reproduzierbar zu visualisieren und zu quantifizieren. Dieses hydroponische, schwimmende Seedling-Wachstumssystem ermöglicht eine mikroskopische Bildgebung und Quantifizierung von Bakterienpopulationen an den Wurzeln von A. thaliana.
Der beschriebene Pflanzen-Mikroben-Interaktionstest integriert nützliche Elemente bestehender experimenteller Protokolle. Die Floating Mesh-Methode basierte auf der von Haney et al.13, die die anfängliche Besiedlung von P. simiae WCS417r auf statischen, schwimmenden A. thaliana Sämlingen maß. Bei der Bewertung dieses Systems wurde eine starke Kolonisierung der A. thaliana-Wurzeln durch P. simiae validiert, obwohl ein anderes Wachstumsmedium als Haney et al. genutzt wurde und orbitales Schütteln während der Kolonisation beinhaltete. Die Einbeziehung des Orbitalschüttelns während der Besiedlung und Wartung erleichtert bakterielle Wechselwirkungen, die in der statischen Kultur möglicherweise nicht auftreten, sowie anoxische Bedingungen zu reduzieren, die sowohl das bakterienische Wachstum als auch die Pflanzenwurzelgesundheit hemmen können13. Wir integrierten auch Aspekte der mikrobiologischen Protokolle entwickelt, um Pflanzenwurzelbesiedlung durch verschiedene Bakterienartenzuunterstützen 8,15,25. Dazu gehörte ein entscheidender Transferschritt aus dem für die bakterielle Besiedlung optimierten Medium in ein für das Pflanzenwachstum optimiertes Medium. Diese Übertragung auf frisches Medium wird es auch ermöglichen, die Mechanismen, die der bakteriellen Erhaltung an Den Wurzelnzugrunde liegen, anzugehen, ein Ansatz, der Einblicke in die erratische Aufrechterhaltung von PGPB in Feldversuchen 6 liefern kann.
Dieser Test wurde für die schnelle Verarbeitung mehrerer Proben optimiert, damit Umweltvariablen und gemischte Bakteriengemeinschaften innerhalb einer multi-well biologischen Replikation untersucht werden können. Während sich die Ultraschall-Beschallung bisher als ausreichend für die Störung und Sammlung von Rhizosphärenbakterien erwiesen hat, beschleunigt die 24-Well-Platte und die Mehrzangenhornaufsatzdiebeung die Probenverarbeitung. Dieser Ansatz zur Berechnung der Zelllebensfähigkeit zur Quantifizierung der bakteriellen Präsenz könnte durch qPCR oder MiSeq 16S rRNA Gen-Community-Profiling ergänzt oder erweitert werden, um die relative Häufigkeit vielfältigerer Gemeinschaften von kolonisierenden Bakterien zu bestimmen. 20. Darüber hinaus wird während der Bildgebung der Nutzen der Fokussierung auf nur drei Regionen jeder Pflanzenwurzel hervorgehoben, um die Visualisierung der bakteriellen Präsenz und Lokalisierung an den Wurzeln zu beschleunigen. Die Besiedlung dieser verschiedenen Wurzelregionen unterscheidet sich nachweislich zwischen den Bakterienarten14. Die Bildgebung kann entweder mit natürlich autofluoreszierenden Bakterien oder genetisch zuvorkommenden Bakterien durchgeführt werden, die entwickelt wurden, um ein fluoreszierendes Protein auszudrücken.
Die hier beschriebene Methodik ermöglicht eine schnelle und reproduzierbare Bewertung der Wurzelbesiedlung durch PGPB-Bakterien, aber es gibt Einschränkungen für die Schlussfolgerungen, die aus diesen Experimenten gezogen werden können. Zum Beispiel, die Fähigkeit für Bakterien, Chemotax in Richtung der Wurzel ist bekannt, wichtig für viele Bakterienarten Besiedlung von Pflanzenwurzeln, aber dieser Prozess kann nicht innerhalb dieses schüttelnden Impfsystems erforderlich sein. Für Studien, die speziell an Chemotaxis interessiert sind, könnte der Besiedlungsschritt jedoch in der statischen Flüssigkeitskultur oder auf der Oberfläche eines weichen Agarmediums durchgeführt werden, wo Bakterien weit von der Pflanze entfernt plattiert werden könnten, wodurch sie sich aktiv in Richtung der wurzel. Darüber hinaus wurde ein relativ reiches Wachstumsmedium während der Kolonisation verwendet, um das bakterienwachstum und die Pflanzenanhaftung zu fördern; Diese vergleichsweise hohen Nährstoffkonzentrationen können jedoch die Untersuchung der bakteriellen Nutzung oder des Wettbewerbs um pflanzlichen Kohlenstoff während der Besiedlung verbieten. Auch hier kann das Besiedlungsmedium je nach den Wachstumsanforderungen der untersuchten Bakterien am besten auf die jeweiligen Forschungsfragen bestimmter Forscher abgestimmt werden.
Dieses System wurde entwickelt, um leicht zugänglich zu sein, um verschiedene bakterielle und pflanzenwachsende Bedingungen und die Zugabe von verschiedenen Umweltstressoren und Zeitpunkten zu ermöglichen. Die hier beschriebenen Methoden eignen sich jedoch am besten zur Messung bakterieller Wechselwirkungen mit den Wurzeln von A. thaliana Sämlingen. Die Sammlung wurde für diese Anlage optimiert, und größere oder empfindlichere Pflanzen können im schwimmenden Multi-Well-Plattensystem unlösbar sein. Schließlich, während die Bakterien von Interesse hier verwendet besiedeln die Pflanzenwurzel in flüssiger Kultur, für andere Bakterien kann es notwendig sein, die Pflanzenwurzeln durch Dip-Impfung oder Beschichtung auf einem festen Agar Medium statt19zu impfen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Forschungsmittel des Department of Energy Biological and Environmental Research (DOE-BER 0000217519 to E.A.S.), der National Science Foundation (INSPIRE IOS-1343020 to E.A.S), unterstützt. SLH wurde auch vom National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program unterstützt. Wir danken Dr. Jeffery Dangl für die Bereitstellung von Bakterienstämmen und unschätzbareEinblicke. Wir danken Dr. Andrew Klein und Matthew J. Powers für experimentelle Vorschläge. Schließlich möchte sLH sich bei den Verbindungen in den sozialen Medien dafür bedanken, dass sie uns daran erinnert haben, dass die Verbreitung von Wissenschaft ein Privileg und eine Verantwortung ist, insbesondere durch kreative und zugängliche Mittel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Required Materials | |||
| 1.5 mL eppendorf tubes | any | N/A | |
| 24-well plates | BD Falcon | 1801343 | |
| Aeraseal | Excel Scientific | BE255A2 | |
| Autoclave | any | N/A | |
| Bacteria of Interest | any | N/A | Stored at -80?C in 40% glycerol preferred |
| BactoAgar | BD | 2306428; REF 214010 | |
| bleach | any | N/A | |
| Conviron | any | N/A | Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21?C, with inner power outlet |
| Dessicator Jar: glass or heavy plastic | any | N/A | |
| Ethanol | any | N/A | |
| Flame | any | N/A | |
| Forceps | any | N/A | |
| Incubator | any | N/A | At optimal temperature for growth of specified bacteria |
| Hydrochloric Acid | any | N/A | |
| Lennox LB Broth | RPI | L24066-1000.0 | |
| Microcentrifuge | any | N/A | |
| Micropipetters | any | N/A | Volumes 5 µL to 1000 µL |
| Microscope (preferably fluorescence) | any | N/A | Could be light if best definition not important |
| MS Salts + MES | RPI | M70300-50.0 | |
| Orbital Plate Shaker | any | N/A | Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours |
| Petri Dishes | any | N/A | 50 mL total volume |
| Reservoirs | any | N/A | |
| Spectrophotometer | any | N/A | |
| Standard Hole Punch | any | N/A | Approximately 7mm punch diameter |
| Sterile water | any | N/A | |
| Surgical Tape | 3M | MMM1538-1 | |
| Teflon Mesh | McMaster-Carr | 1100t41 | |
| Ultrasonicator | any | N/A | |
| Vortex Mixer | any | N/A | |
| X-gal | GoldBio | x4281c | other vendors available |
| Suggested Materials | |||
| 24 Prong Ultrasonicator attachment | any | N/A | For sonicating multiple samples at once. Can be done individually |
| Alumaseal II | Excel Scientific | FE124F | |
| Glass beads | any | N/A | |
| Multipetter/Repetter | any | N/A | |
| Sterile 96-well plates | any | N/A | For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes |
| Biological Materials Used | |||
| Arabidopsis thaliana seeds | any | N/A | We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks |
| Arthrobacter nicotinovorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Curtobacterium oceanosedimentum | Levy, et al. 2018 | ||
| Microbacterium oleivorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Pseudomonas simiae WCS417r | Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017 |
References
- Strange, R. N., Scott, P. R. Plant disease: a threat to global food security. Annual Review of Phytopathology. 43, 83-116 (2005).
- Cook, A. M., Grossenbacher, H., Hütter, R. Isolation and cultivation of microbes with biodegradative potential. Experientia. 39 (11), 1191-1198 (1983).
- Vacheron, J., et al. Plant growth-promoting rhizobacteria and root system functioning. Fronteirs in Plant Science. 4, 356 (2013).
- Backer, R., et al. Plant Growth-Promoting Rhizobacteria: Context, Mechanisms of Action, and Roadmap to Commercialization of Biostimulants for Sustainable Agriculture. Fronteirs in Plant Science. 9, 1473 (2018).
- Zamioudis, C., Pieterse, C. M. Modulation of host immunity by beneficial microbes. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (2), 139-150 (2012).
- Kröber, M., et al. Effect of the strain Bacillus amyloliquefaciens FZB42 on the microbial community in the rhizosphere of lettuce under field conditions analyzed by whole metagenome sequencing. Frontiers in Microbiology. 5, 252 (2014).
- Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
- Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
- Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research. Frontiers in Microbiology. 7, 773 (2016).
- Shank, E. A. Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions. Journal of Visual Experiments. (80), e50863 (2013).
- Woodward, A. W., Bartel, B. Biology in Bloom: A Primer on the Arabidopsis thaliana Model System. Genetics. 208 (4), 1337-1349 (2018).
- Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biology. 14, 69 (2014).
- Haney, C. H., Samuel, B. S., Bush, J., Ausubel, F. M. Associations with rhizosphere bacteria can confer an adaptive advantage to plants. Nature Plants. 1 (6), (2015).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Townsley, L., Yannarell, S. M., Huynh, T. N., Woodward, J. J., Shank, E. A. Cyclic di-AMP Acts as an Extracellular Signal That Impacts. MBio. 9 (2), (2018).
- Beauregard, P. B., Chai, Y., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Bacillus subtilis biofilm induction by plant polysaccharides. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (17), E1621-E1630 (2013).
- Matthysse, A. G. Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory. Journal of Visual Experiments. 136 (136), (2018).
- Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. Journal of Visual Experiments. (60), (2012).
- Cole, B. J., et al. Genome-wide identification of bacterial plant colonization genes. PLoS Biology. 15 (9), e2002860 (2017).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).
- Grandchamp, G. M., Caro, L., Shank, E. A. Pirated Siderophores Promote Sporulation in Bacillus subtilis. Applied Environmental Microbiology. 83 (10), (2017).
- Gange, A. C., Gadhave, K. R. Plant growth-promoting rhizobacteria promote plant size inequality. Science Reports. 8 (1), 13828 (2018).
- Levy, A., et al. Genomic features of bacterial adaptation to plants. Nature Genetics. 50 (1), 138-150 (2018).
- Martínez-Hidalgo, P., Maymon, M., Pule-Meulenberg, F., Hirsch, A. M. Engineering root microbiomes for healthier crops and soils using beneficial, environmentally safe bacteria. Canada Journal of Microbiology. , 1-14 (2018).
- Niu, B., Kolter, R. Quantification of the Composition Dynamics of a Maize Root-associated Simplified Bacterial Community and Evaluation of Its Biological Control Effect. Bio Protocol. 8 (12), (2018).
