Summary
Burada bir hidroponik bitki büyüme tahlil türler varlığı ölçmek ve bitki kökleri ilk kolonizasyon ve farklı büyüme ortamları içine transfer edildikten sonra bakterilerin uzamsal dağılımı görselleştirmek için açıklanmaktadır.
Abstract
Bakteriler, etkileşen mikroplar, daha büyük organizmalar ve Abiotik çevre ile şekillendirilen kompleks rizosfer 'de microbiomes oluşturur. Laboratuvar koşullarında, bitki büyüme teşvik bakteri (pgpb) tarafından rizosfer 'de kolonizasyon sağlığını veya kolonize bitkiler göreli ev sahibi bitkilerin gelişimini artırabilir. Ancak, alan ayarlarında, PGPB ile bakteriyel tedaviler genellikle bitkileri için önemli faydalar sağlamaz. Bir açıklama bu bitki ömrü boyunca endojen toprak mikroplar ile etkileşimler sırasında PGPB kaybı nedeniyle olabilir olmasıdır. Bu olasılık, çoğu çalışmada rizosfer 'de topluluklar içinde pgpb bakım yerine ilk kolonizasyon odaklanmak beri, onaylamak zor olmuştur. Burada hipotez, montaj, birlikte olma ve bakteriyel toplulukların Bakımı rizosfer 'de mikroortamın deterministic özellikleri ile şekillendirilir ve bu etkileşimlerin yerel ayarlarında pgpb hayatta kalma etkileyebilir. Bu davranışları incelemek için, bir hidroponik bitki büyüme tahlil ölçmek ve bitki kökleri ilk kolonizasyon sırasında bakterilerin uzamsal dağılımı görselleştirmek ve farklı büyüme transfer sonra Arabidopsis thaliana kullanılarak optimize edilmiştir Ortam. Bu sistemin yeniden üretilebilirliği ve yarar daha sonra iyi okudu PGPB Pseudomonas simiaeile doğrulanır. Birden fazla bakteriyel türün varlığının bitki kökü üzerinde kolonizasyon ve bakım dinamiklerini nasıl etkileyebileceğini araştırmak için, üç bakteriyel sudan bir model topluluğu (bir Arthrobacter, Curtobacteriumve microbacterium türleri) aslen A. thaliana rizosfer 'de 'den izole edilmiştir. Bu farklı bakteriyel türlerin varlığı bu Hidroponik bitki-bakım tahlil kullanılarak ölçülebilir gösterilmiştir, hangi sıralama tabanlı bakteriyel toplum çalışmaları için bir alternatif sağlar. Bu sistemi kullanarak gelecekteki çalışmalar multispecies bitki mikrobiomes zaman içinde ve değişen çevresel koşullarda bakteriyel davranışlar anlayışını artırabilir.
Introduction
Bakteriyel ve mantar hastalıklarla mahsul imha azaltılan gıda üretimi ile sonuçlanır ve ciddi küresel istikrar bozabilir1. Bastırıcı topraklarda mikropların bitki sağlığı artırmak için sorumlu olduğunu keşif dayanarak2, bilim adamları bitki mikrobiome varlığı ve belirli bolluğu değiştirerek bitki büyümesini desteklemek için yararlanarak olup olmadığını sordu bakteriyel türler3. Bitki büyüme veya gelişim yardım bulundu bakteri topluca bitki büyüme teşvik bakteri (PGPB) olarak adlandırılır. Daha yakın zamanda, çalışmalar sadece potansiyel pgpb tanımlamak için nasıl toprak, kökleri etrafında veya rizosfer 'de (bölge doğrudan çevreleyen ve kök yüzeyi dahil) pgpb etkileyebilir nasıl interkingdom etkileşimleri anlamak için kaymıştır Etkinlik4.
PGPB tarafından Rhizosphere kolonizasyonu, kolonize edilmemiş tesislere göre çeşitli streslere yanıt olarak ev sahibi tesislerin sağlığını veya gelişimini artırabilir5. Ancak, sonuçlar sıklıkla doğal toprak koşullarında yakından kontrollü sera ve laboratuar ayarlarında gözlenen göre daha değişkendir6. Bu fark için bir hipotez, pgpb 'nin büyüme veya davranışının7,8' deki yerli toprak bakterileri veya mantarları tarafından önlenmesi olabilir. Rizosfer 'de bakterilerin yararlı etkileri genellikle 1 bakteri yeteneğine bağlıdır) bulmak ve köküne doğru hareket, 2) biyofilm oluşumu ile kök kolonize, ve 3) küçük molekül üretimi ile ev sahibi bitki veya patojenler ile etkileşim metabolitler7,9. Bu kolonizasyon davranışları herhangi komşu mikropların varlığı ve aktivite etkilenebilir10.
Rizosfer 'de 'in bu farklı bakteriyel kolonizasyon aşamalarını ölçmek ve görselleştirecek bir sistem tasarladık (Şekil 1). Bu yaklaşım, uzun vadeli PGPB bakımının bazen bitkilerin önceden inoculated Fide dikimi sırasında olduğu gibi yeni ortamlar içine aktarılması sonrasında nasıl gözlemlendiği konusunda araştırmalar yapmayı kolaylaştıracaktır. Arabidopsis thaliana olarak laboratuvar çalışmalarında geniş kullanımı yanı sıra mikrobiyal etkileşimleri hakkında mevcut geniş veri nedeniyle bir bitki modeli olarak seçildi11. Sistemde üç aşama vardır: 1) A. thaliana büyüme, 2) bakteriyel kolonizasyon, ve 3) bakteriyel bakım (bkz. Şekil 1). Çünkü a. thaliana bir karasal bitki, bu Hydroponic sistemi12içinde gereksiz su stres acı olmadığını sağlamak için önemliydi. Haney ve el.13tarafından kullanılan yöntemlerden esinlenerek, fide sıvı büyüme ortamından çekimi ayırmak için plastik mesh üzerinde yetiştirilen. Bu sistem sağlık ve bitki Konağı gelişimi tehlikeye görünmüyor ve sıvı11 bir. thaliana büyüme geliştirir. Bitki çekimi yüzeyin üzerinde yüzen gibi, kökleri tamamen sıvı bakteriyel büyüme ortamına aşı bakteriler tarafından kolonizasyon maruz kalır. Bu ilgi bakteriler en büyüme için elverişli besin kolonizasyon için incelenmesini sağlar, daha sonra bitki büyüme desteklemek için tasarlanmış bir besin ortamında büyüyen devam etmek için koşullar değişen süre. Her iki aşamada da kök13kanda oksijen azlığı önlemek için sabit sallayarak içerir. Bakteriler, kolonizasyon ortamından veya bakım ortamına transfer edildikten sonra bitki köklerinden görüntülenebilir veya niceleyilebilir. Bu hidroponik sistem çok esnektir, deneysel koşullara izin verir ve uygulamalı stresler araştırmacılar ilgi alanlarına bağlı olarak kolayca değiştirilecektir.
Bu tanımlanan yöntem, bitki-mikrobe etkileşimleri hakkında literatürde daha büyük gövde bağlamında önemlidir, çünkü kök yüzeyinde bu etkileşimlerin incelenmesi için sağlam bir sistem sağlar, çünkü aynı zamanda büyüme tercihlerine göre özelleştirilebilir farklı bakteriler. Bitki biyoloji laboratuvarları genellikle katı agar bitki mikrobe kolonizasyon denemeleri gerçekleştirmek, sadece düzlemsel hareket için izin (Eğer bu) bakteri de sonraki transfer sırasında bitkilerin potansiyel olarak yıkıcı manipülasyon gerektirirken. Buna karşılık, Mikrobiyoloji laboratuvarları genellikle onların deneyler içinde bakterilerin sağlığını önceliklenmiş, bitkilerin zarar için14,15. Bitki ve Mikrobiyoloji odaklı laboratuvarlar bu farklı öncelikleri tarihsel zor bu gruplar arasında sonuçları karşılaştırmak için yapılmış, çünkü her genellikle ilgi organizmalarını optimize etmek için deneysel koşulları optimize15. Burada açıklanan yüzen Mesh-bitki-büyüme sistemi tam bitki dalgıç, önceki Mikrobiyoloji odaklı çalışmalar için önemli bir avantaj önler, aynı zamanda geçici kolonizasyon kolaylaştırmak için bakteri büyüme ve hayatta kalma optimize ederken. Böylece, biz burada mevcut tahlil her iki bitki biyologlar (aşırı hidrasyon ve bitki dokunsal manipülasyon hakkında) mikrobiyologlar kriterleri tatmin ederken (farklı bakteriyel büyüme koşulları ve birden fazla izin kaygıları adres olabilir tür etkileşimleri)7. Bu protokol çeşitli bakteriler, bitkiler ve çevresel koşullar ile kullanılmak üzere uyarlanabilir şekilde tasarlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: deneysel kurulum, netlik için açıklanmıştır ve bu rapora dahil edilen temsili sonuçları oluşturmak için kullanılır, ancak koşullar istediğiniz gibi değiştirilebilir. Kullanılan bakterilerin BSL durumuna göre, tüm adımlar KKD kullanılarak ve güvenlik için kurumsal ve Federal kaldığımız aşağıdaki yapılmalıdır.
1. bakterilerin karakterizasyonu
- Büyüme orta agar plaka üzerinde bakterilerin morfolojisi belirleyin. Yaklaşık bir OD600 = 0,5 ve plaka bir 1 μL hacim tercih agar orta üzerine resuspend hücreleri. Özel bakteriyel topluluğun bireysel üyelerini daha iyi ayırt etmek için 20 mg/mL 'Lik son konsantrasyon için agar plakalarına X-GAL ekleyin. Kolonilerin formuna kadar 24 °C veya 30 °C ' de büyütün, sonra koloni morfolojisine ait resimler ve notlar alın.
- Her bir bakteriyel gerilimin optik yoğunluğu ve mL16başına CFU (koloni şekillendirme üniteleri) sayısı arasındaki korelasyon tanımlayın. Yaklaşık bir OD600 = 5 için 24-iyi plaka su 1 ml içinde resuspend bakteriler, iki kat seri seyreltme gerçekleştirmek, tüm seyreltme od600 izlemek, ve plaka her her örnekteki uygulanabilir CFU/ml belirlemek için birden fazla optik yoğunlukları.
- Her bakteriyel gerginlik için maksimum sonication toleransı belirleyin. Bunu yapmak için, bir 24-kuyu plaka sıvı orta içeren içine kısım hücreleri, bir unsonicated kontrol örneği olarak bazı hücreler rezerve. 24 uçlu bir boynuz eki ile bir ultrasonicator kullanarak, 2 s darbeleri ile 40 amfi at sonication 12 s üç tur uygulayın.
Not: 24-iyi ultrasonicator kullanımı, ancak bir mikroipucu ile donatılmış bir ultrasonicator kullanın ve bağımsız olarak her örnek sonication gerçekleştirmek, üretim tesisi örneklerinin akış çoğullama kolaylaştırmak için tavsiye edilir. Her zaman en az 25 NRR koruması için derecelendirilmiştir earmuffs giymek. - On-sonicated ve unsonicated numuneler ve nokta agar plakaları üzerinde 10 kat seri seyreltme gerçekleştirin. Sonication sonra uygun hücrelerde bir azalma olup olmadığını belirleyin. Eğer öyleyse, yeni bir örnek kullanın ve tedavi son CFU/mL17üzerinde hiçbir etkisi olana kadar azalan toplam sonication zaman veya genlik kullanarak sonication adım tekrarlayın.
2. plastik bir kafes üzerinde Arabidopsis thaliana fide hazırlanması
- Standart bir delik puncher kullanarak plastik Mesh diskleri oluşturun.
- Alüminyum folyo gevşek bir kapak ile bir cam kap içinde diskleri toplamak ve bir otoklav 20 dk kuru döngüsü13ayarlamak kullanarak sterilize.
- Alev sterilize Cımbız kullanarak, bir bitki büyüme-orta agar plaka yüzeyinde tek bir katmanda yaklaşık 40 sterilize Mesh diskleri dağıtın. Kullanmak 0.5 x Murashige ve Skoog (MS) tuzları, içeren 500 mg/L mes tampon [2-(N-morpholino) etesulfonik asit] ve 1,5% Bacto agar, bitki büyüme orta olarak, ile 50 μg/ml Benomyl fide, mantar kontaminasyon limitine eklendi.
- Daha önce17açıklandığı gibi A. thaliana akıenik tohumları hazırlayın.
- Yaklaşık 100 – 300 tohum her bir raf ve bir duman kaputu bir resealable cam veya ağır Plastik Konteyner ("jar") içine bireysel santrifüjler tüpleri içine yerleştirin.
- Dikkatli kullanarak, kavanoz içine çamaşır suyu 100 ml bir kabı koyun, çamaşır suyu için konsantre HCL 3 ml ekleyin ve hemen kavanoz mühür ve en az 4 h için tohumları sterilize etmek dumanı izin.
- Dikkatle kavanoz ve mühür altında sterilize tohum tüpleri kaldırın.
- Her kafes merkezinde iki tohum yerleştirin. Cerrahi bantla mühür plakaları ve 2 – 6 gün boyunca 4 °C ' de karanlıkla tohumların vernalize edilmesi için inküye yapın.
- Fidanları çimdikmek ve büyümek için, kısa gün ayarlarında 8 – 10 gün boyunca bir bitki büyüme odasına plaka agar yan yere yerleştirin: 21 °C ' de 9 h ışık ve 18 °C ' de 15 h karanlık (Şekil 1, adım 2).
3. sıvı bakteriyel büyüme ortamında bitkilerin kolonizasyonu
- Sadece medya kontrol kuyuları dışında, steril 24 kuyu plakasının her bir kuyusu için 1 mL bakteriyel büyüme ortamı ekleyin. Kullanım Lennox Luria broth (Tripton 10 g, maya özü 5 g, NaCl 5 g) bakteriyel büyüme ortamı olarak.
- Örgü agar plakalardan sıvı (Şekil 1, adım 3A) gömülü çimlenme fidanları aktarın.
- Yavaşça iki çimlenmiş fide içeren Mesh soyma yukarı ve alev sterilize forseps kullanarak agar plaka kapalı. Eşit büyüklükte ve hasarlı fide ile mesh seçin.
- Agar kaldırma pürüzsüz değilse, bu Mesh ve bitki atın. Bir float her iyi bakteriyel büyüme sıvı, kök yan aşağı aktarın.
- Yüzen fide içeren kuyuları içine bakterileri inoculate.
- Resuspend bakteri bir OD600 için agar plakaları üzerinde gece yetiştirilen 108 CFU/ml bakteriyel büyüme orta sıvı eşdeğer. İyi başına 106 CFU bakteri son konsantrasyon için her iyi Için 10 μL bakteriyel süspansiyon ekleyin.
- Eğer bakteri karışımı hazırlıyorsanız, her biri OD600 için 108 CFU/ml 'ye eşdeğerdir, eşit oranlarda karıştırın ve sıvı iyi başına son karışımı 10 μL ekleyin.
- Steril büyüme için plakayı mühürleyin. Yapışkan tarafa dokunmadan, plaka genelinde gaz geçirgen film dikkatle basın. Her bir kuyu, kuyular tarafından yapılan Yüzüklerin her birinin etrafında basınç uygulayarak ayrı olarak mühürlendiğinden emin olun. Plakanın plastik kapağını, plaka ve gaz geçirgen film üzerinde (Şekil 1, adım 3B) yerine takın.
- Bir bitki büyüme odasında 18 h için plakaları inküye, fide başlangıçta çimlenme olduğu gibi aynı koşullarda, 220 RPM için ayarlanmış bir orbital plaka Shaker dışında.
4. bakteriyel kolonizasyon Bakımı
- Tüm yüzer (Mesh üzerinde bitkiler) durulama için, yeni bir 24-kuyu plaka kuyuları için steril su 1 mL ekleyin. Gaz geçirgen filmi çıkarın. Steril forseps kullanarak, su ile kuyulara transfer yüzer (Şekil 1, adım 4a). Ajitasyon olmadan oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca dinlenerek durulayın.
Not: zaman içinde kolonizasyon korumak için kendi yeteneğini yerine kökleri bakteriyel kolonizasyon verimliliği belirlemek Için, bitkiler adım 5,1 doğrudan alarak bu adımda feda edilebilir. - 1 mL bitki büyüme ortamına sahip yeni 24 kuyu plakasının kuyularını doldurun. Her kuyunda bir kafes aktarın. Bir gaz geçirgen mühür ile kapak ve bitki büyüme odasında 220 RPM orbital plaka Shaker üzerinde 72 h için inkük (Şekil 1, Adım 4B).
- 72 h kuluçk döneminden sonra yüzer ile adım 4,1 olarak gerçekleştirilen durulama tekrarlayın.
5. uygun hücre sayıları için bakteri toplama
Not: fide kökü başına bakteri sayısı herhangi bir inkübasyon timepoint tespit edilebilir. Kolonizasyon 0 saat ile 18 saat arasında izlenebilmektedir, ancak bakım 18 saat sonrasına kadar izlenebilmektedir. Görüntüleme için mukadder bitkiler Bölüm 6 doğrudan devam edebilirsiniz.
- Fidanları Mesh 'ten çıkarın (Şekil 1, adım 5). Yavaşça yaprakları altında alev sterilize forseps yerleştirin (ama Mesh yaprak tarafında), ve hafifçe kök çimdik. Çekirdeklerini yukarı ve uzak kafes onu kırmadan kökünü koparmak için oynatın. Kök kırıldığında, yavaşça tam uzunluğu toplamak için Mesh alt kazımak.
- Bitki kökleri bakteri çıkarın. 1 mL ddH20 içeren 24 kuyu plakasının kuyularına bakterileri aktarın. 1,3 adımda açıklandığı gibi örnekleri sonikat.
Not: mikroskop kullanarak, sonicated örnekteki kök yüzeyinde kalan tüm bakterileri arayın. Bakteri kalırsa, hiçbir bakteri bağlı kalması kadar toplam sonication zaman veya yoğunluğu artırmak, Bölüm 1 ' de belirlendiği gibi uygun hücre sayar etkilemez sonication en üst seviyeye kadar. - Kökleri üzerinde bakteri ölçmek.
- Bakteriyel büyüme ortamında 10-6 seyreltme kadar sonicated numunelerin seri 10-Fold seyreltmeleri gerçekleştirin. Bireysel agar plakalarına her seyreltme 50 μL ekleyin ve steril cam boncuklar (veya bakteriyel Spreader) ile yayılır. Bireysel koloniler sayılana kadar plakaları bakteri için optimum sıcaklıkta inküye.
- Bir kez ayırt, her koloni morfoloji sayısını saymak (Bölüm 1 ' de belirlendiği gibi), ve fide başına her bakteriyel türlerin CFU hesaplayın. Kolonizasyon veya bakım sırasında kontaminasyon bakteriyel varlığı etkileyebilir gibi, kontaminasyon gösteren tüm örnekleri atın.
6. mikroskobik için bozulmamış bitki kökleri koleksiyonu
- Forseps kullanarak, Bölüm 5 ' te olduğu gibi fidanları Meshden çıkarın.
- Her tesisi mikroskop slaytlarına aktarın.
- Slaytta kökünün ucunu yerleştirin ve slaytla Flush aşağı ateş ayarlamak için ucunu uzağa sürükleyin, en iyi görüntüleme için düzleştirilmiş bir kök sağlanması. Kaplamalar ve slaytlar arasında arayüzleri hidrat örnekleri için su veya steril bitki büyüme orta bir damla ekleyin.
- Kök taç ( Şekil 1' de en üst kutulu bölge) hemen üzerinde bir cam lamel magazini yerleştirin ve çekim altında lamel magazini (kök taç görüntüleme için izin vermek için) eğimli önlemek için bırakır ve yavaşça aşağı basın17.
- Floresan bakteriler kullanarak, görüntü uygun uyarılma/emisyon filtreleri kullanarak birbirinden ve bitki kökü18bakteri ayırt etmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İyi karakterize PGPB P. simiae WCS417r hidroponik kültürde A. thaliana kökleri kolonize bilinmektedir. Bu doğal floresan bakterisi, kolonizasyon sonrasında fidanların kökleri üzerindeki mikroskobik kullanarak kolayca görselleştirilebilir (Şekil 2). Bu a. thaliana fide ' (4 – 6 mm uzunluğunda) köklerinin tam uzunluğu görüntü mümkün olmasına rağmen, birçok bitki için bunu yaparken zaman yasak bir miktar alacaktır. Zaman noktaları ve bakteri türleri arasında en çok varyasyon, taç, orta ve kök14 ( Şekil 1' de kırmızı kutular ile gösterilir) ucu görüntüleme tarafından yakalanabilir çünkü, bu bölgeler görüntüleme tam kök yerine görüntü için öncelik vardı Uzunluk. P. simiaeparlak alan görüntüleri-kolonize A. thaliana kökleri (Şekil 2), köklerin ve kök kılların anahat görselleştirmek mümkündür; Ancak, kolonizasyon 18 h, net bir şekilde kolonize ve parlak alan görüntüleri kullanarak kolonize olmayan kökleri ayırt etmek mümkün değildir. P. simiae , autofluorescence görüntülerken, 490-510/520-550 nm18' in Excitation/emisyon dalga boylarını içeren sarı floresan proteini (YFP)19 olarak ifade etmek için de tasarlanan bir gerginlik kullandık. 100x büyütme, a. thaliana kökleri üzerinde P. simiae hücrelerinin bireysel ve küçük toplamları açıkça belirlemek için yeterli oldu. Şekil 2' de gösterildiği gibi, hem yüksek çözünürlüklü Konfokal mikroskoplara ya da daha az pahallı tezgah mikroskoplarına erişim sunan laboratuvarlar, kök boyunca bakterilerin varlığını ve dağılımını görselleştirebilir.
Uzamsal dağılım açısından bilgilendirici olmakla beraber, mikroskobik görüntüler bakteriyel hücrelerin ölçülmesinde iyi uygun değildir. Böylece ultrasonication kullanarak kökleri yüzeyinden bakteri toplanan daha önce açıklanan ve doğrulanmış9,20. Üç tur 12 s ultrasonication21 bir amplitüte 40 kök fide dış yüzeyi bozmak için yeterli Idi (ek Şekil 1) ve bakteriyel viability etkilemeden iken tüm bakterileri kaldırmak. Sonication yerine boncuk-dayak yöntemleri daha iyi bakteriyel agregalar/biyosilmlar dağılma teşvik için kullanıldı. Kolonizasyon 18 h ve bakım ek 72 h sonra CFU/kök ölçülüyor P. simiae hem kolonize ve hidroponik, yüzen fide sistemi A. thaliana kökleri üzerinde tutulur gösterdi (Şekil 3). Her iki timepoint 'te CFU/fide sayısı, farklı günlerde gerçekleştirilen biyolojik çoğaltır arasında iyi bir tekrarlanabilirlik gösterdi (Şekil 3). Gözlenen varyasyon kök kolonizasyon arasında yaygındır22 ve muhtemelen zamanlama küçük varyasyonları nedeniyle, çevresel koşullar, ya da bitki kökü boyutu, fide arasında bile aynı anda çimlenmiş ve boyutu benzer olarak seçildi. Biz CFU sayısında bir artış gözlemlemek/fide sonra 72 h bakım ortamında sonrası kolonizasyon içinde gözlenen sayılar karşılaştırıldığında 18 h timepoint (Şekil 3). Bu bitki kökü üzerinde kolonize bakterilerin aktif büyümesini gösterir bakım aşamasında oluştu.
Bireysel bakteriyel kolonizasyon ve bakım ölçmek için bu hidroponik tahlil yardımcı ek olarak, aynı zamanda bitki kökleri üzerinde birden fazla türün dernek izlenmesi için geçerlidir. Bunu göstermek için, laboratuvar koşullarında doğal toprakta yetiştirilen A. thaliana 'dan izole edilen üç bakteri türü20seçildi. İzolatlar Arthrobacter nicotinovorans, Microbacterium oleivorans ve curtobacterium oceanosedimentum23suşları vardı. Bu basitleştirilmiş toplum, bu türlerin, titreyen kültürde (yayımlanmamış veriler) sıvı bakteriyel büyüme medyasında bir arada bulunabilme yeteneği nedeniyle seçilmiştir. Ayrıca, bu üç tür koloni morfolojisi ve renginde farklılıklar nedeniyle X-GAL içeren medyada açıkça farklılaşabilir (Şekil 4A). X-GAL Bu bakteriyel türlerin herhangi biri (yayımlanmamış veri) göreli büyümesini etkilemez. X-GAL Morfoloji ve koloni görünümü bu farklar bize CFU saymak için izin/antibiyotik seçimi olmadan her türün fide, çok türler coculture bile.
A. nicotinovorans, M. oleivorans, ve C. oceanosedimentum tüm kolonize ve kök üzerinde tutulan, ister tek başına ya da bakteriyel rahim (Şekil 4b). Her tür farklı biyolojik ve teknik çoğaltır arasında benzer eğilimleri gösterdi, hatta karışık topluluklar içinde. Bu tahlil Protokolü hem göreli veya toplam CFU/kök her türün ölçmek için kullanılabilir olduğunu gösterir. İlginçtir, tek başına yetiştirilen, hiçbir bireysel türler bakım aşamasında bolluk bir farkedilebilir bir artış gösterdi, ama genel CFU/kök kombine toplumun cocultures arttı, bu bakterilerin yasaklamak olmadığını gösteren diğer suşların kolonizasyonu.
Tüm deneyler için, bakteri ilavesi olmaksızın sıvı ortamlarda yetiştirilen bitkiler negatif kontroller her zaman dahil edildi. Mikroskopide bu kontrol kökleri üzerinde hiçbir bakteri görünmez (Şekil 2), ne de CFU için kaplama yoluyla algılanan herhangi bir bakteri (yayımlanmamış veri). Bu tohumların sterilizasyonu ve bu tahlil sırasında steril teknikleri kullanarak kasıtlı kolonize sürece bitkiler akenik tutmak için yeterli olduğunu gösterir.
Şekil 1: A. thaliana kökleri üzerinde bakteriyel kolonizasyon ve bakım için tahlil. A. thaliana fide sterilize plastik Mesh yetiştirilen bakteri için optimize edilmiş bir büyüme ortamına transfer edildi [burada, 0,1 x lb (Luria Broth) Lennox]. Bakteri daha sonra kök kolonize 18 h bitki titreyerek sıvı içinde yüzerken. Bir durulama sonrasında, kolonize şamandıra bitkiler için optimize edilmiş bir büyüme ortamına transfer edildi (0.5 x MS + MES) 72 h için kökleri üzerinde bakteri bakımı için test etmek. Float daha sonra durulanır ve herhangi bir bağlı mikroplar ile bitki analiz için kaldırıldı (mikroskobik tarafından CFU/fide veya görüntüleme miktarının). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: floresan mikroskobu ile köklerin P. simiae kolonizasyonu görselleştirilmesi. P. simiae (yanlış renkli yeşil) A. thaliana kökleri kolonize ve bitki büyüme orta transfer aşağıdaki kök üzerinde tutulur. Şekil 1' de belirtilen alanlardan kök taç (sol), orta uzunluklu (merkez) ve uç (sağda), 40X büyütmede gösterilir. Üst iki satır, P. simiae (epifloresan microkopi tarafından görüntülenmiş) tarafından kolonize edilmiş köklerin parlak alan ve floresan görüntülerini gösterir. Aynı kökleri de bir Konfokal mikroskop (Merkez iki satır) tarafından görüntülenmiş. İki alt satırda bakteri yok negatif kontrol hiçbir kolonizasyon gösterdi. Ölçek çubukları 50 μm temsil eder. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Şekil 3: A. thaliana kökleri üzerinde P. simiae 'nin ölçülmesini . A. thaliana fide başına kurtarılan P. simiae geçerli hücrelerin toplam sayısı 18 saat kolonizasyon veya 72 h bakım. Üç bireysel biyolojik çoğaltır gösterilir, her float başına iki fide üç teknik çoğaltır içerir. Gösterilen sayılar, teknik çoğaltır, çubuklar standart hataları temsil ederken anlamına gelir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: a. thaliana kökleri üzerinde karışık bir bakteriyel topluluğun kolonizasyonu ve bakımının ölçülmesini. A. Nicotinovorans, M. oleivorans ve C. oceanosedimentum kolonileri, koloni morfolojisi ve rengi ile X-GAL içeren agar Orta üzerinde farklılaşabilir. (B) 10 gün eski fide kökleri yaklaşık 3x105 CFU/ml her üç suşları ile aşı edildi. Gösterilen toplam CFU/fide her türün ardından kurtarılan 18 kolonizasyon ya da 72 h bakım zaman ya tek başına ya da üç üye bakteriyel toplumda kolonize. Her float başına iki fide iki teknik çoğaltır oluşan iki biyolojik çoğaltır, gösterilir. Gösterilen sayılar iki teknik çoğaltır, çubuklar anlamına gelir standart hataları temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 1: ultrasonication kök yüzeyi bozar. Kök yüzeyinden bakterileri ortadan bırakmak için, tüm bitkiler sonicated, ve bakteri sıvı içine serbest bırakıldı, hangi seri olarak seyreltilmiş ve CFU/fide miktarlama için kaplama. (A) bozulmamış fide (B) yapısal olarak ultrasonication aşağıdaki bozmuş. Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tüm ortamlarda bitkiler milyonlarca farklı bakteri ve mantar5,7ile etkileşim. Bu etkileşimler, bitki sağlığını olumsuz ve olumlu yönde etkileyebilir, ürün verimi ve gıda üretiminde potansiyel etkilere neden olabilir. Son çalışmalar ayrıca PGPBs tarafından bitkileri değişken kolonizasyon öngörülemeyen bitki boyutu ve alan denemeleri22ürün verimi için hesap olabileceğini göstermektedir. Bu etkileşimlerin arkasındaki mekanizmaları anlamak, stres24altında bile sağlıklı bitki gelişimine yardımcı olmak için bitki ilişkili mikrobiyal toplulukları doğrudan manipüle etmemiz için bize izin verebilir.
Köklerin bakteriyel kolonizasyonu ve rizosfer 'de içindeki bakımlarının bitki-mikrobe etkileşimleri için kritik olduğu için9, bu bakteriyel davranışları yeniden şekillendirecek ve ölçmek için bir sistem kurmak istedik. Bu hidroponik, yüzen fide büyüme sistemi mikroskopik görüntüleme ve A. thalianakökleri üzerinde bakteriyel nüfus miktarının ölçmek için izin verir.
Tanımlanan bitki-mikrobe etkileşim tahlil mevcut deneysel protokollerin yararlı unsurları entegre. Yüzen kafes yöntemi, statik, yüzen A. thaliana fide üzerinde P. simiae WCS417r Ilk kolonizasyon ölçülen Haney ve al.13, bu dayanmaktadır. Bu sistemi değerlendirirken, P. simiae tarafından a. thaliana kökleri güçlü kolonizasyon, Haney ve al. farklı bir büyüme ortamı kullanılmıştır ve kolonizasyon sırasında orbital sallayarak dahil olsa bile, doğrulandı. Hem kolonizasyon ve bakım sırasında orbital sallayarak dahil statik kültürde ortaya olmayabilir bakteriyel etkileşimleri kolaylaştırır, hem de bakteriyel büyüme ve bitki kök sağlığını inhibe anoksisik koşulları azaltmak13. Biz de çeşitli bakteriyel türler tarafından bitki kökü kolonizasyonu desteklemek için tasarlanmış Mikrobiyoloji odaklı protokoller entegre yönleri8,15,25. Bu, bakteriyel kolonizasyon için optimize edilmiş orta ve bitki büyümesi için optimize edilmiş bir orta dışarı önemli bir transfer adım dahil. Bu taze orta transfer aynı zamanda kökleri üzerinde bakteriyel bakım temel mekanizmaları ele alınmaya başlar izin verecektir, saha denemeleri6PGPB düzensiz Bakımı içine anlayış sağlayabilir bir yaklaşım.
Bu tahlil birden fazla numune hızlı işleme için çevresel değişkenler ve karışık bakteriyel topluluklar için bir multi-iyi biyolojik çoğaltma içinde tespit etmek için izin optimize edilmiştir. Ultrasonication daha önce bozulma ve rizosfer 'de bakterilerin toplanması için yeterli olduğu gösterilmiştir iken, 24-kuyu plaka ve Multi-Prong boynuz eki örnek işleme hızlandırır. Bakteriyel varlığı ölçmek için bu hücre canlılığı hesaplama yaklaşımı tarafından tamamlanabilir, ya da dahil etmek için genişletilmiş, qPCR veya miseq 16S rRNA gen toplum profil kolonize bakteri daha çeşitli topluluklar göreceli bolluk belirlemek için 20. ek olarak, görüntüleme sırasında, her bitki kökünün sadece üç bölgeye odaklanmanın yarar köklerinde bakteriyel varlığı ve lokalizasyon görselleştirme hızlandırmak için vurgulanır. Bu farklı kök bölgelerin kolonizasyonu bakteriyel türler arasında farklılık göstermiştir14. Görüntüleme, floresan proteini ifade etmek için tasarlanan doğal otofloresan bakteriler veya genetik olarak takip edilen bakteriler ile gerçekleştirilebilir.
Burada açıklanan metodoloji PGPB bakteriler tarafından kök kolonizasyon hızlı ve tekrarlanabilir değerlendirilmesi için izin verir, ama bu deneylerden çekilmiş olabilir sonuçlara sınırlamalar vardır. Örneğin, bakterilerin köküne doğru chemotaks için yeteneği birçok bakteriyel türlerin ' bitki kökleri kolonizasyon için önemli olduğu bilinmektedir, ama bu süreç bu sallayarak aşı sistemi içinde gerekli olmayabilir. Bu, özellikle chemotaxis ilgilenen çalışmalar için, kolonizasyon adım statik sıvı kültürü veya yumuşak bir agar orta yüzeyinde yapılabilir, bakteri bitkiden uzak kaplama olabilir, onları aktif doğru hareket etmek için gerektiren, dedi Kök. Buna ek olarak, kolonizasyon sırasında nispeten zengin bir büyüme ortamı bakteriyel büyüme ve bitki eki teşvik etmek için kullanıldı; Ancak, bu nispeten yüksek besin konsantrasyonları kolonizasyon sırasında bitki kaynaklı karbon için bakteriyel kullanım veya rekabet incelenmesi yasaklayabilir. Yine, incelenmekte olan bakterilerin büyüme gereksinimlerine bağlı olarak, kolonizasyon orta özel araştırmacılar belirli araştırma sorularını en uygun şekilde değişebilir.
Bu sistem, farklı bakteriyel ve bitki büyüme koşullarına ve farklı çevresel stresler ve timepoints ilavesi için kolay bir şekilde tasarlanmıştı. Ancak, burada açıklanan yöntemler en iyi A. thaliana fide kökleri ile bakteriyel etkileşimleri ölçmek için uygundur. Koleksiyon bu bitki için optimize edilmiştir, ve daha büyük veya daha hassas bitkiler yüzen Multi-Well-Plate sistemde inatçı olabilir. Son olarak, ilgi bakteri burada kullanılan sıvı kültürde bitki kökü kolonize ederken, diğer bakteriler için daldırma-inoculation veya katı bir agar Orta üzerinde kaplama tarafından bitki kökleri aşılamak gerekli olabilir19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, enerji biyolojik ve çevresel araştırmalar bölümü (DOE-BER 0000217519 için E.A.S.), Ulusal Bilim Vakfı (E. A. S için IOS-1343020 Ilham) tarafından sağlanan araştırma fonları tarafından destekleniyordu. SLH Ayrıca Ulusal Bilim Vakfı lisansüstü araştırma bursu programı tarafından destekleniyordu. Dr. Jeffery Dangl 'a, bakteriyel suşlar ve paha biçilmez bir anlayış sağlamak için teşekkür ederiz. Biz deneysel öneriler için Dr Andrew Klein ve Matthew J. Powers teşekkür ederiz. Son olarak, SLH bize bilim yaymak bir ayrıcalık ve bir sorumluluk, özellikle yaratıcı ve erişilebilir yollarla olduğunu hatırlatan için sosyal medya bağlantıları teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Required Materials | |||
| 1.5 mL eppendorf tubes | any | N/A | |
| 24-well plates | BD Falcon | 1801343 | |
| Aeraseal | Excel Scientific | BE255A2 | |
| Autoclave | any | N/A | |
| Bacteria of Interest | any | N/A | Stored at -80?C in 40% glycerol preferred |
| BactoAgar | BD | 2306428; REF 214010 | |
| bleach | any | N/A | |
| Conviron | any | N/A | Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21?C, with inner power outlet |
| Dessicator Jar: glass or heavy plastic | any | N/A | |
| Ethanol | any | N/A | |
| Flame | any | N/A | |
| Forceps | any | N/A | |
| Incubator | any | N/A | At optimal temperature for growth of specified bacteria |
| Hydrochloric Acid | any | N/A | |
| Lennox LB Broth | RPI | L24066-1000.0 | |
| Microcentrifuge | any | N/A | |
| Micropipetters | any | N/A | Volumes 5 µL to 1000 µL |
| Microscope (preferably fluorescence) | any | N/A | Could be light if best definition not important |
| MS Salts + MES | RPI | M70300-50.0 | |
| Orbital Plate Shaker | any | N/A | Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours |
| Petri Dishes | any | N/A | 50 mL total volume |
| Reservoirs | any | N/A | |
| Spectrophotometer | any | N/A | |
| Standard Hole Punch | any | N/A | Approximately 7mm punch diameter |
| Sterile water | any | N/A | |
| Surgical Tape | 3M | MMM1538-1 | |
| Teflon Mesh | McMaster-Carr | 1100t41 | |
| Ultrasonicator | any | N/A | |
| Vortex Mixer | any | N/A | |
| X-gal | GoldBio | x4281c | other vendors available |
| Suggested Materials | |||
| 24 Prong Ultrasonicator attachment | any | N/A | For sonicating multiple samples at once. Can be done individually |
| Alumaseal II | Excel Scientific | FE124F | |
| Glass beads | any | N/A | |
| Multipetter/Repetter | any | N/A | |
| Sterile 96-well plates | any | N/A | For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes |
| Biological Materials Used | |||
| Arabidopsis thaliana seeds | any | N/A | We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks |
| Arthrobacter nicotinovorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Curtobacterium oceanosedimentum | Levy, et al. 2018 | ||
| Microbacterium oleivorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Pseudomonas simiae WCS417r | Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017 |
References
- Strange, R. N., Scott, P. R. Plant disease: a threat to global food security. Annual Review of Phytopathology. 43, 83-116 (2005).
- Cook, A. M., Grossenbacher, H., Hütter, R. Isolation and cultivation of microbes with biodegradative potential. Experientia. 39 (11), 1191-1198 (1983).
- Vacheron, J., et al. Plant growth-promoting rhizobacteria and root system functioning. Fronteirs in Plant Science. 4, 356 (2013).
- Backer, R., et al. Plant Growth-Promoting Rhizobacteria: Context, Mechanisms of Action, and Roadmap to Commercialization of Biostimulants for Sustainable Agriculture. Fronteirs in Plant Science. 9, 1473 (2018).
- Zamioudis, C., Pieterse, C. M. Modulation of host immunity by beneficial microbes. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (2), 139-150 (2012).
- Kröber, M., et al. Effect of the strain Bacillus amyloliquefaciens FZB42 on the microbial community in the rhizosphere of lettuce under field conditions analyzed by whole metagenome sequencing. Frontiers in Microbiology. 5, 252 (2014).
- Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
- Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
- Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research. Frontiers in Microbiology. 7, 773 (2016).
- Shank, E. A. Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions. Journal of Visual Experiments. (80), e50863 (2013).
- Woodward, A. W., Bartel, B. Biology in Bloom: A Primer on the Arabidopsis thaliana Model System. Genetics. 208 (4), 1337-1349 (2018).
- Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biology. 14, 69 (2014).
- Haney, C. H., Samuel, B. S., Bush, J., Ausubel, F. M. Associations with rhizosphere bacteria can confer an adaptive advantage to plants. Nature Plants. 1 (6), (2015).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Townsley, L., Yannarell, S. M., Huynh, T. N., Woodward, J. J., Shank, E. A. Cyclic di-AMP Acts as an Extracellular Signal That Impacts. MBio. 9 (2), (2018).
- Beauregard, P. B., Chai, Y., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Bacillus subtilis biofilm induction by plant polysaccharides. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (17), E1621-E1630 (2013).
- Matthysse, A. G. Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory. Journal of Visual Experiments. 136 (136), (2018).
- Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. Journal of Visual Experiments. (60), (2012).
- Cole, B. J., et al. Genome-wide identification of bacterial plant colonization genes. PLoS Biology. 15 (9), e2002860 (2017).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).
- Grandchamp, G. M., Caro, L., Shank, E. A. Pirated Siderophores Promote Sporulation in Bacillus subtilis. Applied Environmental Microbiology. 83 (10), (2017).
- Gange, A. C., Gadhave, K. R. Plant growth-promoting rhizobacteria promote plant size inequality. Science Reports. 8 (1), 13828 (2018).
- Levy, A., et al. Genomic features of bacterial adaptation to plants. Nature Genetics. 50 (1), 138-150 (2018).
- Martínez-Hidalgo, P., Maymon, M., Pule-Meulenberg, F., Hirsch, A. M. Engineering root microbiomes for healthier crops and soils using beneficial, environmentally safe bacteria. Canada Journal of Microbiology. , 1-14 (2018).
- Niu, B., Kolter, R. Quantification of the Composition Dynamics of a Maize Root-associated Simplified Bacterial Community and Evaluation of Its Biological Control Effect. Bio Protocol. 8 (12), (2018).
