الحساسية الإشعاعية للخلايا الجذعية السرطانية في خطوط خلايا سرطان الرئة
Summary
وقد ارتبط وجود الخلايا الجذعية السرطانية مع الانتكاس أو النتائج السيئة بعد العلاج الإشعاعي. تصف هذه المخطوطة طرق دراسة الحساسية الإشعاعية للخلايا الجذعية السرطانية في خطوط خلايا سرطان الرئة.
Abstract
ارتبط وجود الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) بالانتكاس أو النتائج السيئة بعد العلاج الإشعاعي. دراسة CSCs مقاومة للراديو قد توفر أدلة للتغلب على المقاومة الراديوية. تم الإبلاغ عن قناة الكالسيوم ذات البوابات الجهدية α2δ1 الوحدة الفرعية isoform 5 كعلامة لCSCs المقاومة للأشعة في خطوط الخلايا غير الصغيرة سرطان الرئة الخلية (NSCLC). باستخدام قناة الكالسيوم α2δ1 الفرعية كمثال على علامة CSC، يتم عرض طرق لدراسة حساسية الراديو من CSCs في خطوط الخلايا NSCLC. يتم فرز CSCs مع علامات المفترضة عن طريق قياس التدفق، ويتم تقييم قدرة التجديد الذاتي للخلايا التي تم فرزها عن طريق فحص تشكيل المجال. ثم يتم إجراء فحص تشكيل المستعمرة، الذي يحدد عدد الخلايا التي تفقد القدرة على توليد أحفاد تشكيل المستعمرة بعد جرعة معينة من الإشعاع، لتقييم الحساسية الإشعاعية للخلايا المصنفة. تقدم هذه المخطوطة خطوات أولية لدراسة الحساسية الإشعاعية لـ CSCs، والتي ترسي الأساس لزيادة فهم الآليات الأساسية.
Introduction
يلعب العلاج الإشعاعي دورًا مهمًا في علاج السرطان. ومع ذلك، فإن وجود الخلايا الجذعية السرطانية المقاومة للأشعة (CSCs) قد يؤدي إلى الانتكاس أو النتائج السيئة بعد العلاج الإشعاعي1،2. وتتميز CSCs من خلال قدرتها على التجديد الذاتي والقدرة على توليد الخلايا السرطانية غير المتجانسة3. مدرعة مع قدرة إصلاح تلف الحمض النووي أكثر كفاءة أو مستويات أعلى من أنظمة المسح الجذورالحرة أو غيرها من الآليات، CSCs هي مقاومة نسبيا للعلاج الإشعاعي 4،5،6،7 , 8.تحديد علامات CSC واستكشاف آلياتها سوف تسهل تطوير الأدوية التي من شأنها التغلب على المقاومة الإشعاعية دون زيادة تلف الأنسجة الطبيعية.
تم الإبلاغ عن قناة الكالسيوم المسورة بالجهد α2δ1 وحدة isoform 5 كعلامة لCSCs المقاومة للراديو في خطوط الخلايا NSCLC9. تم تحديد α2δ1 في الأصل كعلامة CSC لسرطان الخلايا الكبدية (HCC)10. باستخدام التحصين الطرحي مع زوج من خطوط الخلايا HCC المستمدة من الأورام الأولية والمتكررة في نفس المريض، تم تحديد جسم مضاد اسمه 1B50-1 لاستهداف خلايا HCC المتكررة على وجه التحديد. 1B50-1-إيجابية أظهرت الخلايا كفاءة تشكيل المجال عالية في المختبر والورم العالي في الجسم الحي. تم تحديد مستضدها عن طريق قياس الطيف الكتلي، كقناة الكالسيوم α2δ1 الوحدة الفرعية isoform 5. α2δ1 يعبر على وجه التحديد في CSCs وغير قابل للكشف في معظم الأنسجة العادية، مما يجعلها مرشح محتمل لاستهداف CSCs 10. α2δ1 يمكن أيضا أن تكون بمثابة علامة CSC لخطوط الخلايا NSCLC، وقد ثبت لنقل المقاومة الراديوية لخلايا NSCLC جزئيا عن طريق تعزيز كفاءة إصلاح تلف الحمض النووي استجابة للإشعاع9.
دراسة CSCs مقاومة للراديو قد توفر أدلة للتغلب على المقاومة الراديوية. باستخدام α2δ1 في NSCLC كمثال، يتم عرض الأساليب الرئيسية لدراسة حساسية الراديو من CSCs. عادة، يتم عزل CSCs مع علامة السطح المفترضة، ويتم مقارنة خصائص الخلايا الجذعية والحساسية الإشعاعية من مجموعات الخلايا الإيجابية والسلبية. تشكيل المجال في وسط خالية من المصل تكملها عوامل النمو التي تدعم التجديد الذاتي هو فحص مفيد لتقييم جذع الخلايا في المختبر. الخلايا ذات القدرة العالية على تشكيل المجال من المرجح أن تظهر ورم عالية عند حقنها في الفئران التي تعاني من نقص المناعة10،11،12. ثم يتم استخدام فحص تشكيل المستعمرة لتقييم الحساسية الإشعاعية للخلايا، والتي تحدد عدد الذين فقدوا القدرة على توليد أحفاد تشكيل المستعمرة بعد جرعة من الإشعاع13.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول طرق دراسة الحساسية الإشعاعية لـ CSCs في خطوط الخلايا السرطانية في المختبر. في هذه الدراسة، والتعبير عن α2δ1 مستمر في خطوط الخلايا NSCLC. لذلك، يستند gating على عنصر تحكم isotype. قبل الفرز، يجب فحص تعبير α2δ1 في خطوط خلايا متعددة بواسطة قياس التدفق الخلوي والتحقق من صحتها بواسطة QPCR أ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81402535 و 81672969) والمشروع الوطني للبحث والتطوير الرئيسي (2016YFC0904703).
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA (10X), no phenol red | Thermo Fisher | 15400054 | Dilute in to 0.05% (1X) with autoclaved distilled water |
| 1B50-1 | This antibody is produced and friendly supplied by Laboratory of Carcinogenesis and Translational Reseach (Ministry of Education/Beijing), Department of Cell Biology, Peking University Cancer Hospital and Institute. See reference 10. Alternatively, commercial antibody of calcium channel α2δ1 subunit can be used (ABCAM, ab2864) (Yu, et al., Am J Cancer Res, 2016; 6(9): 2088-2097) | ||
| 4% formaldehyde solution | Solarbio | G2160 | |
| A549 | ATCC | RRID: CVCL_0023 | |
| B27 | Thermo Fisher | 17504044 | |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher | 1336 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5910R | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher | 12500062 | |
| EGF Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0311 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16140071 | |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0261 | |
| Flow cytometer/cell sorter | BD | FACSARIA III | |
| H1299 | ATCC | RRID: CVCL_0060 | |
| H1975 | ATCC | RRID: CVCL_1511 | |
| Lightning-Link Fluorescein Kit | Innova Biosciences | 310-0010 | |
| linear accelerator | VARIAN | CLINAC 600C/D | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M7027 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 11875093 | |
| SYBRGREEN | TOYOBO | QPK-201 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Violet crystal staining solution | Solarbio | G1062 |
Riferimenti
- Brunner, T. B., Kunz-Schughart, L. A., Grosse-Gehling, P., Baumann, M. Cancer stem cells as a predictive factor in radiotherapy. Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 151-174 (2012).
- Baumann, M., Krause, M., Hill, R. Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance. Nature Reviews Cancers. 8 (7), 545-554 (2008).
- Clarke, M. F., et al. Cancer stem cells–perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells. Ricerca sul cancro. 66 (19), 9339-9344 (2006).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Wang, W. J., et al. MYC regulation of CHK1 and CHK2 promotes radioresistance in a stem cell-like population of nasopharyngeal carcinoma cells. Ricerca sul cancro. 73 (3), 1219-1231 (2012).
- Diehn, M., et al. Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells. Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).
- Gomez-Casal, R., et al. Non-small cell lung cancer cells survived ionizing radiation treatment display cancer stem cell and epithelial-mesenchymal transition phenotypes. Molecular Cancer. 12 (1), 94 (2013).
- Mihatsch, J., et al. Selection of radioresistant tumor cells and presence of ALDH1 activity in vitro. Radiotherapy and Oncology. 99 (3), 300-306 (2011).
- Sui, X., Geng, J. H., Li, Y. H., Zhu, G. Y., Wang, W. H. Calcium channel α2δ1 subunit (CACNA2D1) enhances radioresistance in cancer stem-like cells in non-small cell lung cancer cell lines. Cancer Management and Research. 10, 5009-5018 (2018).
- Zhao, W., et al. 1B50-1, a mAb raised against recurrent tumor cells, targets liver tumor-initiating cells by binding to the calcium channel α2δ1 subunit. Cancer Cell. 23 (4), 541-556 (2013).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell. Cancer Letters. 322 (2), 139-147 (2012).
- Zhang, W. C., et al. Glycine decarboxylase activity drives non-small cell lung cancer tumor-initiating cells and tumorigenesis. Cell. 148 (1-2), 259-272 (2012).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- O’Brien, C. A., Kreso, A., Jamieson, C. H. Cancer stem cells and self-renewal. Clinical Cancer Research. 16 (12), 3113-3120 (2010).
- Morgan, M. A., Lawrence, T. S. Molecular pathways: overcoming radiation resistance by targeting DNA damage response pathways. Clinical Cancer Research. 21 (13), 2898-2904 (2015).
- Yu, J., et al. Mechanistic exploration of cancer stem cell marker voltage-dependent calcium channel α2δ1 subunit-mediated chemotherapy resistance in small-cell lung cancer. Clin Cancer Res. 24 (9), 2148-2158 (2018).
