Strahlenempfindlichkeit von Krebsstammzellen in Lungenkrebszelllinien
Summary
Das Vorhandensein von Krebsstammzellen wurde mit Rückfällen oder schlechten Ergebnissen nach der Strahlentherapie in Verbindung gebracht. Dieses Manuskript beschreibt die Methoden zur Untersuchung der Radiosensitivität von Krebsstammzellen in Lungenkrebszelllinien.
Abstract
Das Vorhandensein von Krebsstammzellen (CSCs) wurde mit Rückfällen oder schlechten Ergebnissen nach der Strahlentherapie in Verbindung gebracht. Das Studium radioresistenter CSCs kann Hinweise auf die Überwindung der Funkresistenz liefern. Spannungsgegated Calcium Channel 2 -1 Untereinheit Isoform 5 wurde als Marker für radioresistente CSCs in nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Zelllinien (NSCLC) gemeldet. Anhand der Kalziumkanal-Untereinheit 2 1 als Beispiel für einen CSC-Marker werden Methoden zur Untersuchung der Radiosensitivität von CSCs in NSCLC-Zelllinien vorgestellt. CSCs werden mit vermeintlichen Markern nach Durchflusszytometrie sortiert, und die Selbsterneuerungskapazität sortierter Zellen wird durch Kugelbildungstest ausgewertet. Der Koloniebildungstest, der bestimmt, wie viele Zellen die Fähigkeit verlieren, Nachkommen zu erzeugen, die die Kolonie nach einer bestimmten Dosis Strahlung bilden, wird dann durchgeführt, um die Radioempfindlichkeit sortierter Zellen zu bewerten. Dieses Manuskript enthält erste Schritte zur Untersuchung der Radiosensitivität von CSCs, die die Grundlage für ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen schafft.
Introduction
Die Strahlentherapie spielt eine wichtige Rolle bei der Krebsbehandlung. Die Existenz von radioresistenten Krebsstammzellen (CSCs) kann jedoch nach der Strahlentherapie1,2zu rückfall- oder schlechten Ergebnissen führen. CSCs zeichnen sich durch ihre Selbsterneuerungsfähigkeit und ihre Fähigkeit aus, heterogene Krebszellen zu erzeugen3. Gepanzert mit einer effizienteren DNA-Schadensreparaturkapazität oder höheren Ebenen von Frei-Radikal-Aufräumsystemen oder anderen Mechanismen, CSCs sind relativ resistent gegen Strahlentherapie4,5,6,7 , 8. Die Identifizierung von CSC-Markern und die Erforschung ihrer Mechanismen wird die Entwicklung von Medikamenten erleichtern, die die Radioresistenz überwinden, ohne normale Gewebeschäden zu erhöhen.
Spannungsgegated Calcium-Kanal 2 – 1 Untereinheit Isoform 5 wurde als Marker für radioresistente CSCs in NSCLC-Zelllinien9berichtet. Ursprünglich wurde der CSC-Marker für das hepatozelluläre Karzinom (HCC)10als CSC-Marker identifiziert. Mit subtraktiver Immunisierung mit einem Paar HCC-Zelllinien, die von den primären und rezidivierenden Tumoren bei demselben Patienten abgeleitet wurden, wurde ein Antikörper namens 1B50-1 identifiziert, der speziell auf rezidivierende HCC-Zellen abzielen sollte. 1B50-1-positive Zellen zeigten eine hohe Kugelbildungseffizienz in vitro und eine hohe Tumorigenizität in vivo. Sein Antigen wurde durch Massenspektrometrie identifiziert, als Calciumkanal 2 -1 Untereinheit Isoform 5. Die s21 drückt sich speziell in CSCs aus und ist in den meisten normalen Geweben nicht nachweisbar, was sie zu einem potenziellen Kandidaten für die Ausrichtung auf CSCs10macht. Es hat sich gezeigt, dass nSCLC-Zellen teilweise Radioresistenz gegen NSCLC-Zellen ausstrahlt, indem die Effizienz der REPARATUR von DNA-Schäden als Reaktion auf Strahlung9verbessert wird.
Das Studium radioresistenter CSCs kann Hinweise auf die Überwindung der Funkresistenz liefern. Am Beispiel von NSCLC werden wichtige Methoden zur Untersuchung der Radiosensitivität von CSCs vorgestellt. In der Regel werden CSCs mit einem vermeintlichen Oberflächenmarker isoliert, und die Stammzelleigenschaften und die Radiosensitivität der positiven und negativen Zellpopulationen werden verglichen. Die Kugelbildung in einem serumfreien Medium, ergänzt durch Wachstumsfaktoren, die die Selbsterneuerung unterstützen, ist ein nützlicher Test, um die Stammfähigkeit von Zellen in vitro zu bewerten. Zellen mit hoher Kugelbildungskapazität zeigen wahrscheinlich eine hohe Tumorigenität, wenn sie in immundefizizizizizizizizizizide Mäuse10,11,12injiziert werden. Koloniebildung Assay wird dann verwendet, um die Radiosensitivität von Zellen zu bewerten, die bestimmt, wie viele die Fähigkeit verloren haben, Nachkommen zu erzeugen, die die Kolonie nach einer Dosis von Strahlungbilden 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Untersuchung der Radiosensitivität von CSCs in Krebszelllinien in vitro. In dieser Studie ist die Expression von 2 x 1 in NSCLC-Zelllinien kontinuierlich. Daher basiert Gating auf einer Isotypkontrolle. Vor der Sortierung sollte der Ausdruck 2 x 1 in mehreren Zelllinien durch Durchflusszytometrie untersucht und durch QPCR oder Western Blot validiert werden. Es wird empfohlen, die Expression der sortierten, 2,1-hohen und 2-1-niedrigen Zellen durch Durchflusszytometrie, durch Beoba…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81402535 und 81672969) und dem National Key Research and Development Project (2016YFC0904703) unterstützt.
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA (10X), no phenol red | Thermo Fisher | 15400054 | Dilute in to 0.05% (1X) with autoclaved distilled water |
| 1B50-1 | This antibody is produced and friendly supplied by Laboratory of Carcinogenesis and Translational Reseach (Ministry of Education/Beijing), Department of Cell Biology, Peking University Cancer Hospital and Institute. See reference 10. Alternatively, commercial antibody of calcium channel α2δ1 subunit can be used (ABCAM, ab2864) (Yu, et al., Am J Cancer Res, 2016; 6(9): 2088-2097) | ||
| 4% formaldehyde solution | Solarbio | G2160 | |
| A549 | ATCC | RRID: CVCL_0023 | |
| B27 | Thermo Fisher | 17504044 | |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher | 1336 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5910R | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher | 12500062 | |
| EGF Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0311 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16140071 | |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0261 | |
| Flow cytometer/cell sorter | BD | FACSARIA III | |
| H1299 | ATCC | RRID: CVCL_0060 | |
| H1975 | ATCC | RRID: CVCL_1511 | |
| Lightning-Link Fluorescein Kit | Innova Biosciences | 310-0010 | |
| linear accelerator | VARIAN | CLINAC 600C/D | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M7027 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 11875093 | |
| SYBRGREEN | TOYOBO | QPK-201 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Violet crystal staining solution | Solarbio | G1062 |
Riferimenti
- Brunner, T. B., Kunz-Schughart, L. A., Grosse-Gehling, P., Baumann, M. Cancer stem cells as a predictive factor in radiotherapy. Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 151-174 (2012).
- Baumann, M., Krause, M., Hill, R. Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance. Nature Reviews Cancers. 8 (7), 545-554 (2008).
- Clarke, M. F., et al. Cancer stem cells–perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells. Ricerca sul cancro. 66 (19), 9339-9344 (2006).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Wang, W. J., et al. MYC regulation of CHK1 and CHK2 promotes radioresistance in a stem cell-like population of nasopharyngeal carcinoma cells. Ricerca sul cancro. 73 (3), 1219-1231 (2012).
- Diehn, M., et al. Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells. Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).
- Gomez-Casal, R., et al. Non-small cell lung cancer cells survived ionizing radiation treatment display cancer stem cell and epithelial-mesenchymal transition phenotypes. Molecular Cancer. 12 (1), 94 (2013).
- Mihatsch, J., et al. Selection of radioresistant tumor cells and presence of ALDH1 activity in vitro. Radiotherapy and Oncology. 99 (3), 300-306 (2011).
- Sui, X., Geng, J. H., Li, Y. H., Zhu, G. Y., Wang, W. H. Calcium channel α2δ1 subunit (CACNA2D1) enhances radioresistance in cancer stem-like cells in non-small cell lung cancer cell lines. Cancer Management and Research. 10, 5009-5018 (2018).
- Zhao, W., et al. 1B50-1, a mAb raised against recurrent tumor cells, targets liver tumor-initiating cells by binding to the calcium channel α2δ1 subunit. Cancer Cell. 23 (4), 541-556 (2013).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell. Cancer Letters. 322 (2), 139-147 (2012).
- Zhang, W. C., et al. Glycine decarboxylase activity drives non-small cell lung cancer tumor-initiating cells and tumorigenesis. Cell. 148 (1-2), 259-272 (2012).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- O’Brien, C. A., Kreso, A., Jamieson, C. H. Cancer stem cells and self-renewal. Clinical Cancer Research. 16 (12), 3113-3120 (2010).
- Morgan, M. A., Lawrence, T. S. Molecular pathways: overcoming radiation resistance by targeting DNA damage response pathways. Clinical Cancer Research. 21 (13), 2898-2904 (2015).
- Yu, J., et al. Mechanistic exploration of cancer stem cell marker voltage-dependent calcium channel α2δ1 subunit-mediated chemotherapy resistance in small-cell lung cancer. Clin Cancer Res. 24 (9), 2148-2158 (2018).
