Radiosensibilidad de las células madre del cáncer en las líneas celulares de cáncer de pulmón
Summary
La presencia de células madre cancerosas se ha asociado con recaídas o malos resultados después de la radioterapia. Este manuscrito describe los métodos para estudiar la radiosensibilidad de las células madre cancerosas en las líneas celulares de cáncer de pulmón.
Abstract
La presencia de células madre cancerosas (CSC) se ha asociado con recaídas o malos resultados después de la radioterapia. El estudio de las CCS radiorresistentes puede proporcionar pistas para superar la radiorresistencia. Se ha notificado la isoforma 5 del canal de calcio cerrado por voltaje n.o 21 como un marcador para los CCS radiorresistentes en líneas celulares de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Utilizando la subunidad del canal de calcio 2-1 como ejemplo de un marcador CSC, se presentan métodos para estudiar la radicalidad de los CSC en las líneas celulares NSCLC. Las CSC se clasifican con marcadores putativos por citometría de flujo, y la capacidad de auto-renovación de las células ordenadas se evalúa mediante el ensayo de formación de esferas. El ensayo de formación de colonias, que determina cuántas células pierden la capacidad de generar descendientes que forman la colonia después de una cierta dosis de radiación, se realiza para evaluar la radiación de las células ordenadas. Este manuscrito proporciona los primeros pasos para estudiar la radiosensibilidad de las SC, que establece la base para una mayor comprensión de los mecanismos subyacentes.
Introduction
La radioterapia desempeña un papel importante en el tratamiento del cáncer. Sin embargo, la existencia de células madre de cáncer radioresistentes (CCS) puede provocar recaídas o malos resultados después de la radioterapia1,2. Las CSC se caracterizan por su capacidad de auto-renovación y capacidad para generar células cancerosas heterogéneas3. Blindados con una capacidad de reparación de daños por ADN más eficiente o niveles más altos de sistemas de barrido de radicales libres u otros mecanismos, los CSC son relativamente resistentes a la radioterapia4,5,6,7 , 8. Identificar los marcadores CSC y explorar sus mecanismos facilitará el desarrollo de fármacos que superarán la radiorresistencia sin aumentar el daño tisular normal.
Se ha notificado la isoforma 5 del canal de calcio cerrado por tensión n.o 21 como un marcador para los CCS radiorresistentes en las líneas celulares DeNC9. El número 2 1 fue identificado originalmente como un marcador CSC para el carcinoma hepatocelular (HCC)10. Utilizando la inmunización sustractiva con un par de líneas celulares hcc derivadas de los tumores primarios y recurrentes en el mismo paciente, se identificó un anticuerpo llamado 1B50-1 para apuntar específicamente a las células recurrentes del HCC. Las células 1B50-1-positivas mostraron una alta eficiencia de formación de esferas in vitro y alta tumorigeniidad in vivo. Su antígeno fue identificado por espectrometría de masas, como el canal de calcio 2-1 subunidad isoform 5. El n.o 21 expresa específicamente en los CoS y es indetectable en la mayoría de los tejidos normales, lo que lo convierte en un candidato potencial para apuntar a los CSC10. El número 21 también puede servir como un marcador CSC para las líneas celulares NSCLC, y se ha demostrado que imparteradiorresistencia a las células NSCLC parcialmente mejorando la eficiencia de la reparación de daños al ADN en respuesta a la radiación 9.
El estudio de las CCS radiorresistentes puede proporcionar pistas para superar la radiorresistencia. Utilizando el n.o 2-1 en el NSCLC como ejemplo, se presentan los métodos principales para estudiar la radiosensibilidad de los SCP. Por lo general, los CCS se aíslan con un marcador de superficie putativa, y se comparan las características de las células madre y la radiosensibilidad de las poblaciones de células positivas y negativas. La formación de esferas en un medio libre de suero complementado con factores de crecimiento que apoyan la autorrenovación es un ensayo útil para evaluar la talla de las células in vitro. Es probable que las células con alta capacidad de formación de esferas muestren una alta tumorigeniidad cuando se inyectan en ratones inmunodeficientes10,11,12. El ensayo de formación de colonias se utiliza entonces para evaluar la radiación de las células, que determina cuántos han perdido la capacidad de generar descendientes que forman la colonia después de una dosis de radiación13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe métodos para estudiar la radiosensibilidad de los CI en las líneas celulares cancerosas in vitro. En este estudio, la expresión de 2s 1 es continua en las líneas celulares DeNc. Por lo tanto, el gating se basa en un control de isotipo. Antes de ordenar, la expresión de 2o 1 debe examinarse en varias líneas de celda mediante citometría de flujo y validarse mediante QPCR o western blot. Se recomienda volver a analizar la expresión de 2o1 de las células ordenadas de 2a 1 y 2-baja por citomet…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la National Natural Science Foundation of China (81402535 y 81672969) y National Key Research and Development Project (2016YFC0904703).
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA (10X), no phenol red | Thermo Fisher | 15400054 | Dilute in to 0.05% (1X) with autoclaved distilled water |
| 1B50-1 | This antibody is produced and friendly supplied by Laboratory of Carcinogenesis and Translational Reseach (Ministry of Education/Beijing), Department of Cell Biology, Peking University Cancer Hospital and Institute. See reference 10. Alternatively, commercial antibody of calcium channel α2δ1 subunit can be used (ABCAM, ab2864) (Yu, et al., Am J Cancer Res, 2016; 6(9): 2088-2097) | ||
| 4% formaldehyde solution | Solarbio | G2160 | |
| A549 | ATCC | RRID: CVCL_0023 | |
| B27 | Thermo Fisher | 17504044 | |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher | 1336 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5910R | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher | 12500062 | |
| EGF Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0311 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16140071 | |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0261 | |
| Flow cytometer/cell sorter | BD | FACSARIA III | |
| H1299 | ATCC | RRID: CVCL_0060 | |
| H1975 | ATCC | RRID: CVCL_1511 | |
| Lightning-Link Fluorescein Kit | Innova Biosciences | 310-0010 | |
| linear accelerator | VARIAN | CLINAC 600C/D | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M7027 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 11875093 | |
| SYBRGREEN | TOYOBO | QPK-201 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Violet crystal staining solution | Solarbio | G1062 |
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