Радиочувствительность стволовых клеток рака в линиях клеток рака легких
Summary
Наличие раковых стволовых клеток было связано с рецидивом или плохими исходами после лучевой терапии. Данная рукопись описывает методы изучения радиочувствительности раковых стволовых клеток в линиях раковых клеток легких.
Abstract
Наличие раковых стволовых клеток (CSCs) было связано с рецидивом или плохими исходами после лучевой терапии. Изучение радиорезистентных CSCs может дать ключ к преодолению радиорезистентности. Волтат-gated кальциевый канал No2 ‘1 субъединицы изоформы 5 было сообщено в качестве маркера для радиорезистентных CSCs в немелкоклеточного рака легких (NSCLC) клеточных линий. В качестве примера маркера CSC представлены методы изучения радиочувствительности CSCs в клеточных линиях NSCLC. ЦСР сортируются с помощью ориентировочных маркеров по цитометрии потока, а способность самообновления отсортированных клеток оценивается по оценке формирования сферы. Анализ формирования колонии, который определяет, сколько клеток теряют способность генерировать потомков формирования колонии после определенной дозы излучения, затем осуществляется для оценки радиочувствительности отсортированных клеток. Данная рукопись содержит первые шаги для изучения радиочувствительности CSCs, что закладывает основу для дальнейшего понимания основополагающих механизмов.
Introduction
Радиотерапия играет важную роль в лечении рака. Однако наличие радиорезистентных раковых стволовых клеток (CSCs) может привести к рецидиву или плохим исходам после лучевой терапии1,2. CSCs характеризуются их самообновления способности и способность генерировать неоднородные раковые клетки3. Бронированные с более эффективной способностью восстановления повреждений ДНК или более высокими уровнями свободно-радикальных систем очистки или других механизмов, CSCs относительно устойчивы к лучевой терапии4,5,6,7 , 8.Выявление маркеров CSC и изучение их механизмов будет способствовать разработке препаратов, которые будут преодолевать радиорезистентность без увеличения нормального повреждения тканей.
Voltage-gated кальциевый канал No2 ‘1 субединый изоформ 5 было сообщено в качестве маркера для радиостойких CSCs в NSCLC клеточных линий9. Первоначально был идентифицирован как маркер CSC для гепатоцеллюлярной карциномы (HCC)10. Использование высубтактивной иммунизации с парой линий клеток HCC, полученных из первичных и рецидивирующих опухолей у одного и того же пациента, антитело под названием 1B50-1 было идентифицировано для целевой периодических клеток HCC в частности. 1B50-1-положительные клетки показали высокую эффективность формирования сферы в пробирке и высокую туморигенность in vivo. Его антиген был идентифицирован масс-спектрометрией, как кальциевый канал No2 No1 субунит изоформы 5. No2 No 1 специально выражается в CSCs и не обнаруживается в большинстве нормальных тканей, что делает его потенциальным кандидатом для ориентации CSCs10. Также может служить маркером CSC для клеточных линий NSCLC, и было показано, что он частично придает радиорезистую устойчивость клеткам NSCLC, повышая эффективность восстановления повреждений ДНК в ответ на излучение9.
Изучение радиорезистентных CSCs может дать ключ к преодолению радиорезистентности. В качестве примера можно сделать основные методы изучения радиочувствительности CSC. Как правило, CSCs изолированы с putative маркером поверхности, и характеристики стволовой клетки и радиочувствительность положительных и отрицательных популяций клетки сравниваются. Формирование сферы в среде, свободной от сыворотки, дополненной факторами роста, поддерживающими самообновление, является полезным анализом для оценки стеблий клеток in vitro. Клетки с высокой способностью формирования сферы, вероятно, проявляют высокую опухоленность при введении в иммунодефицитных мышей10,11,12. Колония формирования анализ затем используется для оценки радиочувствительности клеток, который определяет, сколько потеряли способность генерировать потомков формирования колонии после дозы радиации13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает методы для изучения радиочувствительности CSCs в раковых клеточных линий в пробирке. В этом исследовании выражение No2 No1 непрерывна в линиях клеток NSCLC. Таким образом, gating основан на изотипном контроле. Перед сортировкой выражение No2 No1 должно быть исследовано в нес…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81402535 и 81672969) и Национальным проектом ключевых исследований и разработок (2016YFC0904703).
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA (10X), no phenol red | Thermo Fisher | 15400054 | Dilute in to 0.05% (1X) with autoclaved distilled water |
| 1B50-1 | This antibody is produced and friendly supplied by Laboratory of Carcinogenesis and Translational Reseach (Ministry of Education/Beijing), Department of Cell Biology, Peking University Cancer Hospital and Institute. See reference 10. Alternatively, commercial antibody of calcium channel α2δ1 subunit can be used (ABCAM, ab2864) (Yu, et al., Am J Cancer Res, 2016; 6(9): 2088-2097) | ||
| 4% formaldehyde solution | Solarbio | G2160 | |
| A549 | ATCC | RRID: CVCL_0023 | |
| B27 | Thermo Fisher | 17504044 | |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher | 1336 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5910R | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher | 12500062 | |
| EGF Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0311 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16140071 | |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0261 | |
| Flow cytometer/cell sorter | BD | FACSARIA III | |
| H1299 | ATCC | RRID: CVCL_0060 | |
| H1975 | ATCC | RRID: CVCL_1511 | |
| Lightning-Link Fluorescein Kit | Innova Biosciences | 310-0010 | |
| linear accelerator | VARIAN | CLINAC 600C/D | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M7027 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 11875093 | |
| SYBRGREEN | TOYOBO | QPK-201 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Violet crystal staining solution | Solarbio | G1062 |
Riferimenti
- Brunner, T. B., Kunz-Schughart, L. A., Grosse-Gehling, P., Baumann, M. Cancer stem cells as a predictive factor in radiotherapy. Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 151-174 (2012).
- Baumann, M., Krause, M., Hill, R. Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance. Nature Reviews Cancers. 8 (7), 545-554 (2008).
- Clarke, M. F., et al. Cancer stem cells–perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells. Ricerca sul cancro. 66 (19), 9339-9344 (2006).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Wang, W. J., et al. MYC regulation of CHK1 and CHK2 promotes radioresistance in a stem cell-like population of nasopharyngeal carcinoma cells. Ricerca sul cancro. 73 (3), 1219-1231 (2012).
- Diehn, M., et al. Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells. Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).
- Gomez-Casal, R., et al. Non-small cell lung cancer cells survived ionizing radiation treatment display cancer stem cell and epithelial-mesenchymal transition phenotypes. Molecular Cancer. 12 (1), 94 (2013).
- Mihatsch, J., et al. Selection of radioresistant tumor cells and presence of ALDH1 activity in vitro. Radiotherapy and Oncology. 99 (3), 300-306 (2011).
- Sui, X., Geng, J. H., Li, Y. H., Zhu, G. Y., Wang, W. H. Calcium channel α2δ1 subunit (CACNA2D1) enhances radioresistance in cancer stem-like cells in non-small cell lung cancer cell lines. Cancer Management and Research. 10, 5009-5018 (2018).
- Zhao, W., et al. 1B50-1, a mAb raised against recurrent tumor cells, targets liver tumor-initiating cells by binding to the calcium channel α2δ1 subunit. Cancer Cell. 23 (4), 541-556 (2013).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell. Cancer Letters. 322 (2), 139-147 (2012).
- Zhang, W. C., et al. Glycine decarboxylase activity drives non-small cell lung cancer tumor-initiating cells and tumorigenesis. Cell. 148 (1-2), 259-272 (2012).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- O’Brien, C. A., Kreso, A., Jamieson, C. H. Cancer stem cells and self-renewal. Clinical Cancer Research. 16 (12), 3113-3120 (2010).
- Morgan, M. A., Lawrence, T. S. Molecular pathways: overcoming radiation resistance by targeting DNA damage response pathways. Clinical Cancer Research. 21 (13), 2898-2904 (2015).
- Yu, J., et al. Mechanistic exploration of cancer stem cell marker voltage-dependent calcium channel α2δ1 subunit-mediated chemotherapy resistance in small-cell lung cancer. Clin Cancer Res. 24 (9), 2148-2158 (2018).
