L'imaging su nanoscala di campioni di tessuto clinico può migliorare la comprensione della patogenesi della malattia. La patologia di espansione (ExPath) è una versione di microscopia di espansione (ExM), modificata per la compatibilità con campioni di tessuto clinico standard, per esplorare la configurazione su nanoscala delle biomolecole utilizzando microscopi tradizionali a diffrazione limitata.
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Articolo metodologico
Imaging nanoscopico delle sezioni dei tessuti umani attraverso l'espansione fisica e isotropica
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nella moderna patologia, la microscopia ottica svolge un ruolo importante nella diagnosi della malattia rivelando strutture microscopiche di campioni clinici. Tuttavia, il limite fondamentale di diffrazione fisica impedisce l'interrogatorio dell'anatomia su nanoscala e dei sottili cambiamenti patologici quando si utilizzano approcci di imaging ottico convenzionali. Qui, descriviamo un protocollo semplice ed economico, chiamato patologia di espansione (ExPath), per l'imaging ottico su nanoscala di tipi comuni di campioni di tessuto primario clinico, inclusi sia tessuto incorporato di paraffina fissa-congelato o formalina (FFPE) Sezioni. Questo metodo aggira il limite di diffrazione ottica trasformando chimicamente i campioni di tessuto in ibrido di idrogel tissutale e espandendoli fisicamente isoquinamente su più scale in acqua pura. A causa dell'espansione, le molecole precedentemente irrisolvibili sono separate e quindi possono essere osservate utilizzando un microscopio ottico convenzionale.
Introduzione
Lo studio dell'organizzazione molecolare dei tessuti in un contesto tridimensionale (3D) può fornire una nuova comprensione delle funzioni biologiche e dello sviluppo della malattia. Tuttavia, questi ambienti su nanoscala sono al di là delle capacità di risoluzione dei microscopi tradizionali a diffrazione limitata (200-300 nm), dove la distanza minima risolvibile, d è definita da d / /NA. Qui è la lunghezza d'onda della luce e NA è l'apertura numerica (NA) del sistema di imaging. Recentemente, la vis....
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Protocollo
1. Preparazione di reagenti e soluzioni di magazzino
-
Preparare i componenti della soluzione di gelling.
NOTA: le concentrazioni di soluzione sono indicate in g/mL (percentuale w/v).- Effettuare le seguenti soluzioni di stock: 38% (w/v) acrilato di sodio (SA), 50% (w/v) acrilammide (AA), 2% (w/v) N, N'-methylenebisacrylamide (Bis), e 29.2% (w/v) cloruro di sodio (NaCl). Sciogliere i composti in acqua doppiamente deionizzata (ddH2O). Utilizzare gli importi della tabella 1 come riferimento; soluzioni preparate possono essere scalate verso l'alto o verso il basso in volume in base alle esigenze. Ad esempio,....
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Risultati
Se il protocollo è stato eseguito con successo (Figura 1), i campioni appariranno come gel piatto e trasparente dopo l'omogeneizzazione meccanica (Figura 3A) e potranno espandersi di un fattore di 3-4,5x in acqua (Figura 3B), fornendo una risoluzione efficace di 70 nm a seconda del fattore di espansione finale e del sistema di imaging utilizzato5,.......
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Discussione
Qui, presentiamo il protocollo ExPath16, una variante di proExM5 che può essere applicata ai tipi più comuni di campioni di biopsia clinica utilizzati in patologia, tra cui FFPE, H&E macchiati, e campioni freschi congelati su vetrini di vetro. La conversione del formato, il recupero dell'antigene e l'immunostaining dei campioni seguono protocolli di uso comune che non sono specifici di ExPath. A differenza del protocollo proExM originale9, ExPath si .......
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Dichiarazioni
Yz e OB sono due degli inventori che hanno richiesto e ottenuto la protezione brevettuale su un sottoinsieme delle tecnologie descritte qui (brevetti USA20190064037A1, WO2018157074A1 e WO2018157048A1).
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Faculty Start-up fund della Carnegie Mellon University (Yz) e dal NIH Director's New Innovator Award (DP2 OD025926-01 a Yz).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 4-idrossi-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| Piastra con fondo in vetro a 6 pozzetti (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acetone | Fischer Scientifc | A18-500 | |
| Acrilammide | Sigma Aldrich | A8887 | |
| Acryloyl-X, SE (AcX) | Invitrogen | A20770 | |
| Agarosio | Fischer Scientifc | BP160-100 | |
| Persolfato di ammonio (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Anticorpo |
| anti-ACTN4 prodotto nel coniglio | Sigma Aldrich | HPA001873 | |
| Anticorpo anti-collagene IV prodotto nel topo | Santa Cruz Biotech | sc-59814 | |
| Anticorpo anti-vimentina prodotto nel pollo | Abcam | ab24525 | |
| Penna idrofobica Aqua Hold II | Dispositivo scientifico | 980402 | |
| mammella Malattia comune Array di tessuti | Abcam | ab178113 | |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | Colorazione nucleare |
| Coltello diamantato n. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Etanolo | Pharmco | 111000200 | |
| Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) 0,5 M | VWR | BDH7830-1 | |
| FFPE Campione di rene | USBiomax | HuFPT072 | |
| Capra | |||
| Anti-pollo IgY (H+L), CF488A | Biotium | 20020 | |
| Capra Anti-pollo IgY (H+L), CF633 | Biotium | 20121 | |
| altamente adsorbitoCapra anti-coniglio IgG (H+L) Altamente adsorbito Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | |
| MAXbind Colorazione Media | Motivo attivo | 15253 | Può essere sostituito con tampone di staning non commerciale a scelta. |
| MAXblock Blocking Medium | Active Motif | 15252 | Può essere sostituito con un tampone di blocco non commerciale a scelta. |
| MAXwash Washing Medium | Active Motif | 15254 | Può essere sostituito con un tampone di lavaggio non commerciale a scelta. |
| Micro cover Glass #1 (24 mm x 60 mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24 mm x 60 mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetrametiletilendiammina (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281 | Acceleratore |
| N,N′-Metilenebisacrilammide | Sigma Aldrich | M7279 | |
| Siero | di capra normaleJackson Immunoresearch | 005-000-121 | Per la preparazione del tampone bloccante. Dipendente dall'ospite animale di anticorpi secondari. |
| Nunclon 4 pozzetti x 5 mL Piatto per colture cellulari | Thermo Fisher | 167063 | Piatto per colture cellulari a |
| 6 pozzetti Nunclon Piatto per colture cellulari a 6 pozzetti | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc 15 mL | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc 50 mL Agitatore | |||
| Pennello | |||
| pH Misuratore | |||
| fosfato Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), 10x Soluzione | Fischer Scientifc | BP399-1 | |
| Piastra di Petri in plastica (100 mm) | Fischer Scientifc | FB0875713 | |
| Grado di biologia molecolare) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Lama di rasoio | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Provette per microcentrifuga Safelock 1,5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Provette per microcentrifuga Safelock 2,0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Acrilato di sodio | Sigma Aldrich | 408220 | |
| Cloruro di sodio | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Citrato di sodio tribasico diidrato | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Tris Base | Fischer Scientifc | BP152-1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Agglutinina di germe di grano marcata con CF640R | Biotium | 29026 | |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
Riferimenti
- Hell, S. W. Far-Field Optical Nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann,....
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Ristampe e permessi
