通过反相液相-质谱法对无细胞蛋白合成代谢的绝对定量

Summary

在这里，我们提出了一个强大的协议，以量化40个化合物参与中央碳和能量代谢在无细胞蛋白质合成反应。无细胞合成混合物用抗氧化剂衍生，使用反相液相色谱进行有效分离，然后使用异位标记的内部标准通过质谱法进行量化。

Abstract

无细胞蛋白合成（CFPS）是蛋白质体外生产的系统和合成生物学的新兴技术。但是，如果 CFPS 要超越实验室，成为一种广泛而标准的及时制造技术，我们必须了解这些系统的性能限制。针对这个问题，我们开发了一个强大的协议，以量化参与糖解的40种化合物，磷酸五氯苯基，三聚碳酸循环，能量代谢和CFPS反应中的副因子再生。该方法使用^{带有13种C-}单一体标记的内部标准，而样品中的化合物则^用12种C-aniline进行衍生。通过反相液相色谱-质谱法（LC/MS）对内部标准和样品进行混合和分析。化合物的共洗脱消除了电子抑制，使代谢物浓度在平均相关系数为0.988的2-3个量级以上进行精确定量。四十种化合物中有五种未加用碱标记，然而，它们仍在CFPS样本中检测到，并采用标准曲线法进行量化。色谱运行大约需要 10 分钟才能完成。综合起来，我们开发了一种快速、可靠的方法，在一次LC/MS运行中分离和准确量化CFPS中涉及的40种化合物。该方法是描述无细胞代谢的一种全面而准确的方法，因此，我们最终能够了解并提高无细胞系统的产量、生产率和能源效率。

Introduction

无细胞蛋白质合成（CFPS）是制造蛋白质和化学品的有前途的平台，这种应用传统上是为活细胞保留的。无细胞系统来自粗细胞提取物，并消除与细胞生长相关的^{并发症1。}此外，CFPS 允许直接访问代谢物和生物合成机械，无需细胞壁干扰。然而，对无细胞过程的性能限制缺乏基本的了解。高通量代谢物定量方法对代谢表征有价值，对代谢计算^{模型2、3、4}的构建至关重要。用于确定代谢物浓度的常见方法包括核磁共振 （NMR）、傅立叶变换红外光谱 （FT-IR）、基于酶的测定法和质谱 （MS）^{5、6、7 ，8}.然而，这些方法往往受限于它们无法同时有效地测量多种化合物，并且通常需要比典型的无细胞反应更大的样本大小。例如，基于酶的检测通常只能用于在运行中量化单个化合物，并且在样本量较小时（如无细胞蛋白合成反应（通常在 10-15 μL 尺度上运行）时受到限制。同时，NMR需要高丰度代谢物来检测和^定量5。 针对这些缺点，色谱方法与质谱（LC/MS）结合提供了几个优点，包括高灵敏度和同时测量多个物种^的能力9;然而，分析复杂性随着被测量物种的数量和多样性而大大增加。因此，开发能够充分实现LC/MS系统高通量潜力的方法非常重要。样品中的化合物通过液相色谱分离，并通过质谱法进行鉴定。化合物的信号取决于其浓度和电电化效率，其中电电化在化合物之间可能有所不同，也可能取决于样品矩阵。

在使用LC/MS对分析物进行量化时，在样品和标准之间实现相同的电电化效率是一项挑战。此外，由于质子亲和力和极^性10的信号分裂和异质性，代谢物多样性的定量变得更加具有挑战性。最后，样品的共解基质也会影响化合物的电电化效率。为了解决这些问题，代谢物可以化学衍生，提高LC/MS系统的分离分辨率和灵敏度，同时在某些情况下减少信号^{分裂10，11}。化学衍生的工作原理是标记代谢物的特定功能组，以调整其物理特性，如电荷或疏水性，以提高电化^效率11。各种标记剂可用于针对不同的功能组（例如，胺、羟基、磷酸盐、碳化物酸等）。Aniline，一种这样的衍生剂，一次瞄准多个功能组，并在亲水分子中加入疏水成分，从而提高其分离分辨率和^信号12。为了解决共发基质电抑制效应，杨和同事开发了一种基于组特定内部标准技术 （GSIST） 标签的技术，其中标准标有^{13 C}阴宁同位素，并与样品^{混合12，13}.代谢物和相应的内部标准自共溶以来具有相同的电化效率，其强度比可用于定量实验样品中的浓度。

在这项研究中，我们开发了一个协议来检测和量化参与糖解的40种化合物，磷酸五氯苯星通路，三聚碳酸循环，能量代谢和CFPS反应中的副因子再生。该方法基于GSIST方法，^{我们使用12种C-}单一素^和13种C-aniline来标记、检测和量化代谢物，使用逆相LC/MS。所有化合物的线性范围跨越2-3个数量级，平均相关系数为0.988。因此，该方法是一种可靠而准确的方法，用于询问无细胞代谢，以及可能全细胞提取物。

Protocol

1. 制备用于使用线标的的试剂 在 pH 4.5 下制备 6 M 丙琳溶液。在发动机罩中工作，将 550 μL 的苯氨酸与 337.5 μL 的 LCMS 级水和 112.5 μL 的 12 M 盐酸 （HCl） 组合在离心管中。涡旋井，储存在4°C。注：Aniline 可在 4°C 下储存 2 个月。注意：Aniline 是剧毒的，应在烟罩中使用。盐酸具有很强的腐蚀性 在 pH 4.5 下制备 6 M 13C 丙宁溶液。将 250 mg的 13C6- 阴宁与 132 ?…

Representative Results

作为概念验证，我们使用该协议对表达绿色荧光蛋白（GFP）的基于大肠杆菌的CFPS系统中的代谢物进行量化。 CFPS反应（14μL）用乙醇淬火和脱蛋白。然后，CFPS 样本用12 个C-aniline 标记，而标准用13 个C-aniline 标记。然后，将标记的样本和标准组合起来并注入 LC/MS（图 1）。该协议使用内部标准检测并量化了40种参与中央碳和能源代谢的代谢物，同时开发?…

Discussion

无细胞系统没有细胞壁，因此可以直接获得代谢物和生物合成机械，而无需复杂的样品制备。然而，在开发彻底和可靠的协议以定量询问无细胞反应系统方面，我们几乎没有做多少工作。在这项研究中，我们开发了一种快速、可靠的方法，用于量化无细胞反应混合物中的代谢物，并可能在全细胞提取物中量化代谢物。复杂混合物中代谢物的单独定量，如无细胞反应或全细胞提取物中的代谢物，由?…

Materials

12C Aniline	Sigma-Aldrich	242284	Aniline 12C
13C labeled aniline	Sigma-Aldrich	485797	Aniline 13C6
3-Phosphoglyceric acid	Sigma-Aldrich	P8877	3PG
Acetic Acid	FisherScientific	AC222140010	ACE
Acetonitrile, LCMS	JT BAKER	9829-03	ACN
Acetyl-coenzyme A	Sigma-Aldrich	A2056	ACA
Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM, 2.1 x 150 mm Column	Waters	186002353	Column
Adenosine diphosphate	Sigma-Aldrich	A2754	ADP
Adenosine monophosphate	Sigma-Aldrich	A1752	AMP
Adenosine triphosphate	Sigma-Aldrich	A2383	ATP
Alpha-ketoglutarate	Sigma-Aldrich	K1128	aKG
Citrate	Sigma-Aldrich	251275	CIT
Cytidine diphosphate	Sigma-Aldrich	C9755	CDP
Cytidine monophosphate	Sigma-Aldrich	C1006	CMP
Cytidine triphosphate	Sigma-Aldrich	C9274	CTP
D-glyceraldehyde 3-phosphate	Sigma-Aldrich	39705	GAP
Erythrose 4-phosphate	Sigma-Aldrich	E0377	E4P
Ethanol	Sigma-Aldrich	EX0276	EtOH
Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge	FisherScientific		Centrifuge
Flavin adenine dinucleotide	Sigma-Aldrich	F6625	FAD
Fructose 1,6-bisphosphate	Sigma-Aldrich	F6803	F16P
Fructose 6-phosphate	Sigma-Aldrich	F3627	F6P
Fumarate	Sigma-Aldrich	F8509	FUM
Gluconate 6-phosphate	Sigma-Aldrich	P7877	6PG
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	GLC
Glucose 6-phosphate	Sigma-Aldrich	G7879	G6P
Glycerol 3-phosphate	Sigma-Aldrich	G7886	Gly3P
Guanosine diphosphate	Sigma-Aldrich	G7127	GDP
Guanosine monophosphate	Sigma-Aldrich	G8377	GMP
Guanosine triphosphate	Sigma-Aldrich	G8877	GTP
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148	HCl
Isocitrate	Sigma-Aldrich	I1252	ICIT
Lactate	Sigma-Aldrich	L1750	LAC
Malate	Sigma-Aldrich	02288	MAL
myTXTL – Sigma 70 Master Mix Kit	ArborBiosciences	507024	Cell-free protein synthesis
N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride	Sigma-Aldrich	03449	EDC
Nicotinamide adenine dinucleotide	Sigma-Aldrich	43410	NAD
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate	Sigma-Aldrich	N5755	NADP
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced	Sigma-Aldrich	481973	NADPH
Nicotinamide adenine dinucleotide reduced	Sigma-Aldrich	N8129	NADH
Oxalacetate	Sigma-Aldrich	O4126	OAA
Phosphoenolpyruvate	Sigma-Aldrich	P0564	PEP
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280	PYR
Ribose 5-phosphate	Sigma-Aldrich	R7750	R5P
Ribulose 5-phosphate	CarboSynth	MR45852	RL5P
Sedoheptulose 7-phosphate	CarboSynth	MS07457	S7P
Succinate	Sigma-Aldrich	S3674	SUCC
Tributylamine	Sigma-Aldrich	90780	TBA
Triethylamine	FisherScientific	O4884	TEA
ultrapure water	FisherScientific	10977-015	water
Uridine diphosphate	Sigma-Aldrich	U4125	UDP
Uridine monophosphate	Sigma-Aldrich	U6375	UMP
Uridine triphosphate	Sigma-Aldrich	U6625	UTP
VWR Heavy Duty Vortex	VWR		Vortex
Water, LCMS	JT BAKER	9831-03	WATER
Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager	Waters		LCMS
Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN	Waters		LCMS
Waters Acquity Qda detector	Waters		LCMS
Waters Empower 3	Waters		Software
Waters LCMS Total Recovery Vial	Waters	186000384c	LCMS Vial