逆相液体クロマトグラフィー-質量分析法による無細胞タンパク質合成代謝の絶対定量
Summary
ここでは、無細胞タンパク質合成反応において中枢炭素およびエネルギー代謝に関与する40種類の化合物を定量するための堅牢なプロトコルを提示する。無細胞合成混合物は、逆相液体クロマトグラフィーを用いて効果的な分離のためにアニリンで誘導体化され、同位体標識内部標準を用いて質量分析法によって定量される。
Abstract
無細胞タンパク質合成(CFPS)は、タンパク質のインビトロ産生のためのシステムおよび合成生物学における新しい技術です。しかし、CFPSが研究室を超えて、時間の製造技術の中で普及し、標準になる場合は、これらのシステムの性能限界を理解する必要があります。この問題に対して、CFPS反応における糖分解、ペントースリン酸経路、トリカルボン酸サイクル、エネルギー代謝および補因子再生に関与する40の化合物を定量する堅牢なプロトコルを開発しました。この方法では、13個の C-アニリンでタグ付けされた内部標準を使用し、サンプル内の化合物は12個の C-アニリンで誘導体化されます。内部標準および試料を混合し、逆相液体クロマトグラフィー質量分析(LC/MS)によって分析した。化合物の共溶出によりイオン抑制が排除され、平均相関係数が0.988であった2~3桁以上の代謝物濃度の正確な定量が可能となった。40個の化合物のうち5種はアニリンでタグ付けされていないが、CFPSサンプルで検出され、標準的な曲線法で定量された。クロマトグラフィーの実行は、完了するまでに約 10 分かかります。まとめると、CFPSに関与する40の化合物を単一のLC/MSランで分離し、正確に定量する高速で堅牢な方法を開発しました。この方法は、無細胞代謝を特徴付ける包括的かつ正確なアプローチであり、最終的には、無細胞システムの歩留まり、生産性、エネルギー効率を理解し、改善することができます。
Introduction
無細胞タンパク質合成(CFPS)は、タンパク質や化学物質の製造に有望なプラットフォームであり、従来は生きている細胞のために予約されてきました。無細胞系は、粗細胞抽出物に由来し、細胞増殖1に関連する合併症を排除する。さらに、CFPSは細胞壁の干渉なしで代謝産物および生合成機械への直接アクセスを可能にする。しかし、無細胞プロセスの性能限界に関する根本的な理解が欠けている。代謝物定量のための高スループット法は、代謝の特性評価に貴重であり、代謝計算モデル2、3、4の構築に不可欠である。代謝産物濃度を決定するために使用される一般的な方法には、核磁気共鳴(NMR)、フーリエ形質転換赤外分光法(FT-IR)、酵素系アッセイ、質量分析(MS)5、6、7などがあります。 、8.しかし、これらの方法は、多くの場合、一度に複数の化合物を効率的に測定できないことによって制限され、多くの場合、典型的な無細胞反応よりも大きいサンプルサイズを必要とします。例えば、酵素ベースのアッセイは、多くの場合、実行で単一の化合物を定量するためにのみ使用することができ、無細胞タンパク質合成反応(通常は10〜15°Lスケールで実行される)のように、サンプルサイズが小さい場合に制限されます。一方、NMRは、検出および定量のための代謝産物の高い量を必要とします5. これらの欠点に対して、質量分析法(LC/MS)と連像のクロマトグラフィー法は、高感度および複数の種を同時に測定する能力を含むいくつかの利点を提供する9;しかし、測定される種の数と多様性に伴い、分析の複雑さが大幅に増加します。したがって、LC/MSシステムの高スループットポテンシャルを十分に実現する方法を開発することが重要です。試料中の化合物は液体クロマトグラフィーで分離され、質量分析によって同定される。化合物のシグナルは、その濃度およびイオン化効率に依存し、そこでイオン化は化合物間で変化し得るし、また、サンプルマトリックスに依存し得る。
LC/MSを使用して分析物を定量する場合、サンプルと規格の間で同じイオン化効率を達成することは課題です。また、プロトン親和性および極性10におけるシグナル分割および不均一性による代謝産物多様性に伴う定量化がより困難となる。最後に、試料の共溶出マトリックスは、化合物のイオン化効率にも影響を与え得る。これらの問題に対処するために、代謝産物を化学的に誘導体化し、LC/MSシステムによる分離分解分解分解と感度を高め、場合によっては信号分割を10、11に減少させることができる。化学誘導体化は、代謝産物の特定の官能基をタグ付けして、電荷や疎水性などの物理的性質を調整してイオン化効率を11上げることによって機能する。種々のタグ付け剤は、異なる官能基(例えば、アミン、ヒドロキシル、リン酸塩、カルボン酸など)を標的とするために使用することができる。アニリンは、そのような誘導体化剤の1つが、一度に複数の官能基を標的とし、親水性分子に疎水性成分を加え、それによってその分離分解能およびシグナル12を増加させる。共溶出マトリックスイオン抑制効果に対処するために、ヤンと同僚は、標準が13Cアニリン同位体でタグ付けされ、サンプルと混合されるグループ固有の内部標準技術(GSIST)ラベリングに基づく技術を開発しました。12、13.代謝産物および対応する内部標準は、共溶成以来同じイオン化効率を有し、その強度比を使用して実験試料中の濃度を定量することができます。
本研究では、CFPS反応における糖分解、ペントースリン酸経路、トリカルボン酸サイクル、エネルギー代謝および補因子再生に関与する40の化合物を検出し、定量するプロトコルを開発した。この方法はGSISTアプローチに基づいており、12のC-アニリンと13のC-アニリンを使用して、逆相LC/MSを使用して代謝産物をタグ付け、検出、定量しました。すべての化合物の線形範囲は、平均相関係数0.988の2〜3桁に及んだ。したがって、この方法は、無細胞代謝、および場合によっては全細胞抽出物を問い合わせるための堅牢で正確なアプローチです。
Protocol
Representative Results
Discussion
無細胞システムは細胞壁を持たないため、複雑なサンプル調製を必要とせずに代謝産物や生合成機械に直接アクセスできます。しかし、細胞のない反応系を定量的に調べるための徹底的で堅牢なプロトコルを開発する作業はほとんど行われていない。本研究では、無細胞反応混合物および全細胞抽出物中の代謝産物を定量する高速で堅牢な方法を開発した。細胞を含まない反応や全細胞抽出?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
記載された研究は、国立がん研究所(https://www.cancer.gov/)から1U54CA210184-01賞を通じてがん代謝物理学センターによって支援されました。コンテンツは著者のみ責任であり、必ずしも国立がん研究所や国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、原稿の作成に何の役割も持っていませんでした。
Materials
| 12C Aniline | Sigma-Aldrich | 242284 | Aniline 12C |
| 13C labeled aniline | Sigma-Aldrich | 485797 | Aniline 13C6 |
| 3-Phosphoglyceric acid | Sigma-Aldrich | P8877 | 3PG |
| Acetic Acid | FisherScientific | AC222140010 | ACE |
| Acetonitrile, LCMS | JT BAKER | 9829-03 | ACN |
| Acetyl-coenzyme A | Sigma-Aldrich | A2056 | ACA |
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM, 2.1 x 150 mm Column | Waters | 186002353 | Column |
| Adenosine diphosphate | Sigma-Aldrich | A2754 | ADP |
| Adenosine monophosphate | Sigma-Aldrich | A1752 | AMP |
| Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A2383 | ATP |
| Alpha-ketoglutarate | Sigma-Aldrich | K1128 | aKG |
| Citrate | Sigma-Aldrich | 251275 | CIT |
| Cytidine diphosphate | Sigma-Aldrich | C9755 | CDP |
| Cytidine monophosphate | Sigma-Aldrich | C1006 | CMP |
| Cytidine triphosphate | Sigma-Aldrich | C9274 | CTP |
| D-glyceraldehyde 3-phosphate | Sigma-Aldrich | 39705 | GAP |
| Erythrose 4-phosphate | Sigma-Aldrich | E0377 | E4P |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | EX0276 | EtOH |
| Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge | FisherScientific | Centrifuge | |
| Flavin adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | F6625 | FAD |
| Fructose 1,6-bisphosphate | Sigma-Aldrich | F6803 | F16P |
| Fructose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | F3627 | F6P |
| Fumarate | Sigma-Aldrich | F8509 | FUM |
| Gluconate 6-phosphate | Sigma-Aldrich | P7877 | 6PG |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | GLC |
| Glucose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | G7879 | G6P |
| Glycerol 3-phosphate | Sigma-Aldrich | G7886 | Gly3P |
| Guanosine diphosphate | Sigma-Aldrich | G7127 | GDP |
| Guanosine monophosphate | Sigma-Aldrich | G8377 | GMP |
| Guanosine triphosphate | Sigma-Aldrich | G8877 | GTP |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | HCl |
| Isocitrate | Sigma-Aldrich | I1252 | ICIT |
| Lactate | Sigma-Aldrich | L1750 | LAC |
| Malate | Sigma-Aldrich | 02288 | MAL |
| myTXTL – Sigma 70 Master Mix Kit | ArborBiosciences | 507024 | Cell-free protein synthesis |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 | EDC |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | 43410 | NAD |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | Sigma-Aldrich | N5755 | NADP |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced | Sigma-Aldrich | 481973 | NADPH |
| Nicotinamide adenine dinucleotide reduced | Sigma-Aldrich | N8129 | NADH |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | OAA |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma-Aldrich | P0564 | PEP |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | PYR |
| Ribose 5-phosphate | Sigma-Aldrich | R7750 | R5P |
| Ribulose 5-phosphate | CarboSynth | MR45852 | RL5P |
| Sedoheptulose 7-phosphate | CarboSynth | MS07457 | S7P |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S3674 | SUCC |
| Tributylamine | Sigma-Aldrich | 90780 | TBA |
| Triethylamine | FisherScientific | O4884 | TEA |
| ultrapure water | FisherScientific | 10977-015 | water |
| Uridine diphosphate | Sigma-Aldrich | U4125 | UDP |
| Uridine monophosphate | Sigma-Aldrich | U6375 | UMP |
| Uridine triphosphate | Sigma-Aldrich | U6625 | UTP |
| VWR Heavy Duty Vortex | VWR | Vortex | |
| Water, LCMS | JT BAKER | 9831-03 | WATER |
| Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity Qda detector | Waters | LCMS | |
| Waters Empower 3 | Waters | Software | |
| Waters LCMS Total Recovery Vial | Waters | 186000384c | LCMS Vial |
Riferimenti
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