Quantification absolue du métabolisme de synthèse des protéines sans cellules par spectrométrie de chromatographie liquide à phase inversée
Summary
Ici, nous présentons un protocole robuste pour quantifier 40 composés impliqués dans le métabolisme central de carbone et d’énergie dans les réactions de synthèse de protéine sans cellules. Le mélange de synthèse sans cellules est dérivé avec de l’aniline pour une séparation efficace à l’aide d’une chromatographie liquide en phase inversée, puis quantifié par spectrométrie de masse à l’aide de normes internes étiquetées isotopiques.
Abstract
La synthèse des protéines sans cellules (CFPS) est une technologie émergente dans les systèmes et la biologie synthétique pour la production in vitro de protéines. Toutefois, si le SCFP veut aller au-delà du laboratoire et devenir une technologie de fabrication répandue et standard juste à temps, nous devons comprendre les limites de performance de ces systèmes. Vers cette question, nous avons développé un protocole robuste pour quantifier 40 composés impliqués dans la glycolyse, la voie de phosphate de pentose, le cycle d’acide tricarboxylique, le métabolisme énergétique et la régénération de cofactor dans les réactions de CFPS. La méthode utilise des normes internes étiquetées avec 13C-aniline, tandis que les composés de l’échantillon sont dérivés de 12C-aniline. Les normes internes et l’échantillon ont été mélangés et analysés par spectrométrie de masse de chromatographie liquide de phase inversée (LC/MS). La co-élution des composés a éliminé la suppression d’ion, permettant la quantification précise des concentrations de métabolites au-dessus de 2-3 ordres de grandeur où le coefficient moyen de corrélation était 0.988. Cinq des quarante composés n’ont pas été étiquetés avec de l’aniline, cependant, ils ont été encore détectés dans l’échantillon DEPFC et quantifiés avec une méthode standard de courbe. La course chromatographique prend environ 10 minutes à compléter. Pris ensemble, nous avons mis au point une méthode rapide et robuste pour séparer et quantifier avec précision 40 composés impliqués dans le SPFC en un seul lcl/MS. La méthode est une approche complète et précise pour caractériser le métabolisme sans cellules, de sorte qu’en fin de compte, nous pouvons comprendre et améliorer le rendement, la productivité et l’efficacité énergétique des systèmes sans cellules.
Introduction
La synthèse des protéines sans cellules (CFPS) est une plate-forme prometteuse pour la fabrication de protéines et de produits chimiques, une application traditionnellement réservée aux cellules vivantes. Les systèmes sans cellules sont dérivés d’extraits de cellules brutes et éliminent les complications associées à la croissance cellulaire1. En outre, le SCFP permet un accès direct aux métabolites et aux machines biosynthétiques sans interférence d’une paroi cellulaire. Cependant, il n’y a pas eu de compréhension fondamentale des limites de rendement des processus sans cellules. Les méthodes à haut débit pour la quantification des métabolites sont précieuses pour la caractérisation du métabolisme et sont essentielles pour la construction de modèles de calculmétaboliques 2,3,4. Les méthodes courantes utilisées pour déterminer les concentrations de métabolites comprennent la résonance magnétique nucléaire (RMN), la spectroscopie à infrarouge transformateur (FT-IR) de Fourier, les essais à base d’enzymes et la spectrométrie de masse (MS)5,6,7 ,8. Cependant, ces méthodes sont souvent limitées par leur incapacité à mesurer efficacement plusieurs composés à la fois et nécessitent souvent une taille d’échantillon supérieure aux réactions typiques sans cellules. Par exemple, les essais à base d’enzymes ne peuvent souvent être utilisés que pour quantifier un seul composé dans une course, et sont limités lorsque la taille de l’échantillon est petite, comme dans les réactions de synthèse des protéines sans cellules (généralement exécuté sur une échelle de 10-15 L). Pendant ce temps, la RMN exige une forte abondance de métabolites pour la détection et la quantification5. À l’égard de ces lacunes, les méthodes de chromatographie en tandem avec la spectrométrie de masse (LC/MS) offrent plusieurs avantages, y compris une sensibilité élevée et la capacité de mesurer plusieurs espèces simultanément9; cependant, la complexité analytique augmente considérablement avec le nombre et la diversité des espèces mesurées. Il est donc important de développer des méthodes qui réalisent pleinement le potentiel de haut débit des systèmes LC/MS. Les composés d’un échantillon sont séparés par chromatographie liquide et identifiés par spectrométrie de masse. Le signal du composé dépend de sa concentration et de son efficacité d’ionisation, où l’ionisation peut varier d’un composé à l’autre et peut également dépendre de la matrice de l’échantillon.
Atteindre la même efficacité d’ionisation entre l’échantillon et les normes est un défi lorsque vous utilisez LC/MS pour quantifier les analytes. En outre, la quantification devient plus difficile avec la diversité des métabolites en raison de la division du signal et de l’hétérogénéité dans l’affinité des protons et la polarité10. Enfin, la matrice de co-élutation de l’échantillon peut également affecter l’efficacité de l’ionisation des composés. Pour résoudre ces problèmes, les métabolites peuvent être dérivés chimiquement, ce qui augmente la résolution et la sensibilité de séparation par les systèmes LC/MS, tout en diminuant simultanément le fractionnement du signal dans certains cas10,11. La dérivation chimique fonctionne en étiquetant des groupes fonctionnels spécifiques de métabolites pour ajuster leurs propriétés physiques comme la charge ou l’hydrophobicité pour augmenter l’efficacité de l’ionisation11. Divers agents de marquage peuvent être utilisés pour cibler différents groupes fonctionnels (p. ex. amines, hydroxyles, phosphates, acides carboxyliques, etc.). L’aniline, l’un de ces agents de dérivation, cible plusieurs groupes fonctionnels à la fois, et ajoute un composant hydrophobe dans les molécules hydrophiles, augmentant ainsi leur résolution de séparation et le signal12. Pour faire face à l’effet de suppression des ions de la matrice co-étui, Yang et ses collègues ont mis au point une technique basée sur l’étiquetage de la technologie standard interne spécifique au groupe (GSIST) lorsque les normes sont étiquetées avec des isotopes aniin de 13C et mélangées à l’échantillon. 12,13. Le métabolite et la norme interne correspondante ont la même efficacité d’ionisation puisqu’ils co-éliment, et leur rapport d’intensité peut être utilisé pour quantifier la concentration dans l’échantillon expérimental.
Dans cette étude, nous avons développé un protocole pour détecter et quantifier 40 composés impliqués dans la glycolyse, la voie de phosphate de pentose, le cycle d’acide tricarboxylique, le métabolisme énergétique et la régénération cofactorielle dans les réactions de CFPS. La méthode est basée sur l’approche GSIST, où nous avons utilisé 12C-aniline et 13C-aniline pour étiqueter, détecter et quantifier les métabolites à l’aide de LC/MS en phase inversée. La plage linéaire de tous les composés s’étendait sur 2-3 ordres de grandeur avec un coefficient de corrélation moyen de 0,988. Ainsi, la méthode est une approche robuste et précise pour interroger le métabolisme sans cellules, et peut-être des extraits de cellules entières.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les systèmes sans cellules n’ont pas de paroi cellulaire, il y a donc un accès direct aux métabolites et aux machines biosynthétiques sans avoir besoin d’une préparation complexe de l’échantillon. Cependant, très peu de travail a été fait pour développer des protocoles complets et robustes pour interroger quantitativement les systèmes de réaction sans cellules. Dans cette étude, nous avons développé une méthode rapide et robuste pour quantifier les métabolites dans les mélanges de réaction sans cellule…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les travaux décrits ont été soutenus par le Center on the Physics of Cancer Metabolism par le biais du prix Numéro 1U54CA210184-01 du National Cancer Institute (https://www.cancer.gov/ ). Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles de l’Institut national du cancer ou des National Institutes of Health. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.
Materials
| 12C Aniline | Sigma-Aldrich | 242284 | Aniline 12C |
| 13C labeled aniline | Sigma-Aldrich | 485797 | Aniline 13C6 |
| 3-Phosphoglyceric acid | Sigma-Aldrich | P8877 | 3PG |
| Acetic Acid | FisherScientific | AC222140010 | ACE |
| Acetonitrile, LCMS | JT BAKER | 9829-03 | ACN |
| Acetyl-coenzyme A | Sigma-Aldrich | A2056 | ACA |
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM, 2.1 x 150 mm Column | Waters | 186002353 | Column |
| Adenosine diphosphate | Sigma-Aldrich | A2754 | ADP |
| Adenosine monophosphate | Sigma-Aldrich | A1752 | AMP |
| Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A2383 | ATP |
| Alpha-ketoglutarate | Sigma-Aldrich | K1128 | aKG |
| Citrate | Sigma-Aldrich | 251275 | CIT |
| Cytidine diphosphate | Sigma-Aldrich | C9755 | CDP |
| Cytidine monophosphate | Sigma-Aldrich | C1006 | CMP |
| Cytidine triphosphate | Sigma-Aldrich | C9274 | CTP |
| D-glyceraldehyde 3-phosphate | Sigma-Aldrich | 39705 | GAP |
| Erythrose 4-phosphate | Sigma-Aldrich | E0377 | E4P |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | EX0276 | EtOH |
| Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge | FisherScientific | Centrifuge | |
| Flavin adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | F6625 | FAD |
| Fructose 1,6-bisphosphate | Sigma-Aldrich | F6803 | F16P |
| Fructose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | F3627 | F6P |
| Fumarate | Sigma-Aldrich | F8509 | FUM |
| Gluconate 6-phosphate | Sigma-Aldrich | P7877 | 6PG |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | GLC |
| Glucose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | G7879 | G6P |
| Glycerol 3-phosphate | Sigma-Aldrich | G7886 | Gly3P |
| Guanosine diphosphate | Sigma-Aldrich | G7127 | GDP |
| Guanosine monophosphate | Sigma-Aldrich | G8377 | GMP |
| Guanosine triphosphate | Sigma-Aldrich | G8877 | GTP |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | HCl |
| Isocitrate | Sigma-Aldrich | I1252 | ICIT |
| Lactate | Sigma-Aldrich | L1750 | LAC |
| Malate | Sigma-Aldrich | 02288 | MAL |
| myTXTL – Sigma 70 Master Mix Kit | ArborBiosciences | 507024 | Cell-free protein synthesis |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 | EDC |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | 43410 | NAD |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | Sigma-Aldrich | N5755 | NADP |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced | Sigma-Aldrich | 481973 | NADPH |
| Nicotinamide adenine dinucleotide reduced | Sigma-Aldrich | N8129 | NADH |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | OAA |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma-Aldrich | P0564 | PEP |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | PYR |
| Ribose 5-phosphate | Sigma-Aldrich | R7750 | R5P |
| Ribulose 5-phosphate | CarboSynth | MR45852 | RL5P |
| Sedoheptulose 7-phosphate | CarboSynth | MS07457 | S7P |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S3674 | SUCC |
| Tributylamine | Sigma-Aldrich | 90780 | TBA |
| Triethylamine | FisherScientific | O4884 | TEA |
| ultrapure water | FisherScientific | 10977-015 | water |
| Uridine diphosphate | Sigma-Aldrich | U4125 | UDP |
| Uridine monophosphate | Sigma-Aldrich | U6375 | UMP |
| Uridine triphosphate | Sigma-Aldrich | U6625 | UTP |
| VWR Heavy Duty Vortex | VWR | Vortex | |
| Water, LCMS | JT BAKER | 9831-03 | WATER |
| Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity Qda detector | Waters | LCMS | |
| Waters Empower 3 | Waters | Software | |
| Waters LCMS Total Recovery Vial | Waters | 186000384c | LCMS Vial |
Riferimenti
- Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14, 261-269 (2012).
- Vilkhovoy, M., et al. Sequence specific modeling of E. coli cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 7 (8), 1844-1857 (2018).
- Vilkhovoy, M., Minot, M., Varner, J. D. Effective dynamic models of metabolic networks. IEEE Life Sciences Letters. 2 (4), 51-54 (2016).
- Horvath, N., et al. Toward a genome scale sequence specific dynamic model of cell-free protein synthesis in Escherichia coli. bioRxiv. , 215012 (2017).
- Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass spectrometry reviews. 26 (1), 51-78 (2007).
- Hajjaj, H., Blanc, P. J., Goma, G., François, J. Sampling techniques and comparative extraction procedures for quantitative determination of intra- and extracellular metabolites in filamentous fungi. FEMS Microbiology Letters. 164 (1), 195-200 (1998).
- Ruijter, G. J. G., Visser, J. Determination of intermediary metabolites in Aspergillus niger. Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 295-302 (1996).
- Mailinger, W., Baltes, M., Theobald, U., Reuss, M., Rizzi, M. In vivo analysis of metabolic dynamics in Saccharomyces cerevisiae: I. Experimental observations. Biotechnology and Bioengineering. 55 (2), 305-316 (1997).
- Dunn, W. B., et al. Mass appeal: metabolite identification in mass spectrometry-focused untargeted metabolomics. Metabolomics. 9 (1), 44-66 (2013).
- Huang, T., Toro, M., Lee, R., Hui, D. S., Edwards, J. L. Multi-functional derivatization of amine, hydroxyl, and carboxylate groups for metabolomic investigations of human tissue by electrospray ionization mass spectrometry. Analyst. 143 (14), 3408-3414 (2018).
- Huang, T., Armbruster, M. R., Coulton, J. B., Edwards, J. L. Chemical Tagging in Mass Spectrometry for Systems Biology. Analytical Chemistry. 91 (1), 109-125 (2019).
- Yang, W. C., Sedlak, M., Regnier, F. E., Mosier, N., Ho, N., Adamec, J. Simultaneous quantification of metabolites involved in central carbon and energy metabolism using reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry and in vitro 13C labeling. Analytical Chemistry. 80 (24), 9508-9516 (2008).
- Jannasch, A., Sedlak, M., Adamec, J., Metz, T. O. Quantification of Pentose Phosphate Pathway (PPP) Metabolites by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS). Metabolic Profiling. Methods in Molecular Biology 708 (Methods and Protocols). , 159-171 (2011).
- Luo, B., Groenke, K., Takors, R., Wandrey, C., Oldiges, M. Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway, and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1147 (2), 153-164 (2007).
