Cuantificación absoluta del metabolismo de síntesis de proteínas sin células por cromatografía líquida de fase inversa-espectrometría de masas
Summary
Aquí, presentamos un protocolo robusto para cuantificar 40 compuestos involucrados en el metabolismo central de carbono y energía en reacciones de síntesis de proteínas libres de células. La mezcla de síntesis sin células se deriva con anilina para una separación efectiva utilizando cromatografía líquida de fase inversa y luego se cuantifica mediante espectrometría de masas utilizando estándares internos etiquetados isotópicamente.
Abstract
La síntesis de proteínas sin células (CFPS) es una tecnología emergente en sistemas y biología sintética para la producción in vitro de proteínas. Sin embargo, si CFPS va a ir más allá del laboratorio y convertirse en una tecnología de fabricación generalizada y estándar justo a tiempo, debemos entender los límites de rendimiento de estos sistemas. Hacia esta pregunta, desarrollamos un protocolo robusto para cuantificar 40 compuestos involucrados en la glucólisis, la vía del fosfato de pentosa, el ciclo del ácido tricarboxílico, el metabolismo energético y la regeneración cofactorente en las reacciones de CFPS. El método utiliza estándares internos etiquetados con 13C-anilina, mientras que los compuestos en la muestra se derivacon 12C-anilina. Las normas internas y la muestra se mezclaron y analizaron mediante cromatografía líquida en fase inversa-espectrometría de masas (LC/MS). La co-elución de compuestos eliminó la supresión iónial, permitiendo la cuantificación precisa de las concentraciones de metabolitos sobre 2-3 órdenes de magnitud donde el coeficiente de correlación promedio fue de 0,988. Cinco de los cuarenta compuestos no fueron etiquetados con anilina, sin embargo, todavía se detectaron en la muestra de CFPS y cuantificados con un método de curva estándar. La carrera cromatográfica tarda aproximadamente 10 minutos en completarse. En conjunto, desarrollamos un método rápido y robusto para separar y cuantificar con precisión 40 compuestos involucrados en CFPS en una sola ejecución de LC/MS. El método es un enfoque integral y preciso para caracterizar el metabolismo libre de células, de modo que, en última instancia, podamos comprender y mejorar el rendimiento, la productividad y la eficiencia energética de los sistemas libres de células.
Introduction
La síntesis de proteínas sin células (CFPS) es una plataforma prometedora para la fabricación de proteínas y productos químicos, una aplicación que tradicionalmente se ha reservado para células vivas. Los sistemas libres de células se derivan de extractos de células brutas y eliminan las complicaciones asociadas con el crecimiento celular1. Además, CFPS permite el acceso directo a metabolitos y la maquinaria biosintética sin la interferencia de una pared celular. Sin embargo, se ha escaso una comprensión fundamental de los límites de rendimiento de los procesos sin células. Los métodos de alto rendimiento para la cuantificación de metabolitos son valiosos para la caracterización del metabolismo y son críticos para la construcción de modelos computacionales metabólicos2,3,4. Los métodos comunes utilizados para determinar las concentraciones de metabolitos incluyen resonancia magnética nuclear (RMN), espectroscopia de infrarrojo sórdida transformación de Fourier (FT-IR), ensayos basados en enzimas y espectrometría de masas (MS)5,6,7 ,8. Sin embargo, estos métodos a menudo están limitados por su incapacidad para medir eficientemente múltiples compuestos a la vez y a menudo requieren un tamaño de muestra mayor que las reacciones típicas libres de células. Por ejemplo, los ensayos basados en enzimas a menudo solo se pueden utilizar para cuantificar un solo compuesto en una carrera, y son limitados cuando el tamaño de la muestra es pequeño, como en las reacciones de síntesis de proteínas libres de células (normalmente se ejecutan en una escala de 10-15 l). Mientras tanto, la RMN requiere una gran abundancia de metabolitos para la detección y cuantificación5. Hacia estas deficiencias, los métodos de cromatografía en conjunto con la espectrometría de masas (LC/MS) proporcionan varias ventajas, incluyendo alta sensibilidad y la capacidad de medir múltiples especies simultáneamente9; sin embargo, la complejidad analítica aumenta considerablemente con el número y la diversidad de especies que se miden. Por lo tanto, es importante desarrollar métodos que se den cuenta plenamente del potencial de alto rendimiento de los sistemas LC/MS. Los compuestos de una muestra se separan mediante cromatografía líquida y se identifican mediante espectrometría de masas. La señal del compuesto depende de su concentración y eficiencia de ionización, donde la ionización puede variar entre compuestos y también puede depender de la matriz de muestra.
Lograr la misma eficiencia de ionización entre la muestra y los estándares es un desafío cuando se utiliza LC/MS para cuantificar analitos. Además, la cuantificación se vuelve más difícil con la diversidad de metabolitos debido a la división de señales y la heterogeneidad en la afinidad de protones y la polaridad10. Por último, la matriz de co-elución de la muestra también puede afectar a las eficiencias de ionización de los compuestos. Para abordar estos problemas, los metabolitos pueden ser derivados químicamente, aumentando la resolución de separación y la sensibilidad de los sistemas LC/MS, al mismo tiempo que disminuyen la división de señal en algunos casos10,11. La derivación química funciona etiquetando grupos funcionales específicos de metabolitos para ajustar sus propiedades físicas como la carga o la hidrofobicidad para aumentar la eficiencia de la ionización11. Se pueden utilizar varios agentes de etiquetado para dirigirse a diferentes grupos funcionales (por ejemplo, aminas, hidroxilo, fosfatos, ácidos carboxílicos, etc.). Aniline, uno de estos agentes de derivación, se dirige a múltiples grupos funcionales a la vez, y añade un componente hidrófobo en moléculas hidrófilas, aumentando así su resolución de separación y señal12. Para abordar el efecto de supresión de iones de matriz de elución conjunta, Yang y sus compañeros de trabajo desarrollaron una técnica basada en el etiquetado de la Tecnología Estándar Interna Específica del Grupo (GSIST) donde los estándares están etiquetados con 13isótopos de anilina C y se mezclan con la muestra 12,13. El metabolito y el estándar interno correspondiente tienen la misma eficiencia de ionización, ya que co-eluto, y su relación de intensidad se puede utilizar para cuantificar la concentración en la muestra experimental.
En este estudio, desarrollamos un protocolo para detectar y cuantificar 40 compuestos involucrados en la glucólisis, la vía del fosfato de pentosa, el ciclo del ácido tricarboxílico, el metabolismo energético y la regeneración cofactorente en las reacciones de CFPS. El método se basa en el enfoque GSIST, donde usamos 12C-anilina y 13C-anilina para etiquetar, detectar y cuantificar metabolitos utilizando LC/MS de fase inversa. El rango lineal de todos los compuestos abarcó 2-3 órdenes de magnitud con un coeficiente de correlación promedio de 0.988. Por lo tanto, el método es un enfoque robusto y preciso para interrogar el metabolismo libre de células, y posiblemente extractos de células enteras.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los sistemas libres de células no tienen pared celular, por lo que hay acceso directo a metabolitos y la maquinaria biosintética sin necesidad de una preparación compleja de la muestra. Sin embargo, se ha hecho muy poco trabajo para desarrollar protocolos exhaustivos y robustos para interrogar cuantitativamente a los sistemas de reacción libres de células. En este estudio, desarrollamos un método rápido y robusto para cuantificar metabolitos en mezclas de reacción sin células y potencialmente en extractos de cé…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo descrito fue apoyado por el Centro de Física del Metabolismo del Cáncer a través del Premio Número 1U54CA210184-01 del Instituto Nacional del Cáncer ( https://www.cancer.gov/ ). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales del Instituto Nacional del Cáncer o de los Institutos Nacionales de Salud. Los funderos no tenían ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.
Materials
| 12C Aniline | Sigma-Aldrich | 242284 | Aniline 12C |
| 13C labeled aniline | Sigma-Aldrich | 485797 | Aniline 13C6 |
| 3-Phosphoglyceric acid | Sigma-Aldrich | P8877 | 3PG |
| Acetic Acid | FisherScientific | AC222140010 | ACE |
| Acetonitrile, LCMS | JT BAKER | 9829-03 | ACN |
| Acetyl-coenzyme A | Sigma-Aldrich | A2056 | ACA |
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM, 2.1 x 150 mm Column | Waters | 186002353 | Column |
| Adenosine diphosphate | Sigma-Aldrich | A2754 | ADP |
| Adenosine monophosphate | Sigma-Aldrich | A1752 | AMP |
| Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A2383 | ATP |
| Alpha-ketoglutarate | Sigma-Aldrich | K1128 | aKG |
| Citrate | Sigma-Aldrich | 251275 | CIT |
| Cytidine diphosphate | Sigma-Aldrich | C9755 | CDP |
| Cytidine monophosphate | Sigma-Aldrich | C1006 | CMP |
| Cytidine triphosphate | Sigma-Aldrich | C9274 | CTP |
| D-glyceraldehyde 3-phosphate | Sigma-Aldrich | 39705 | GAP |
| Erythrose 4-phosphate | Sigma-Aldrich | E0377 | E4P |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | EX0276 | EtOH |
| Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge | FisherScientific | Centrifuge | |
| Flavin adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | F6625 | FAD |
| Fructose 1,6-bisphosphate | Sigma-Aldrich | F6803 | F16P |
| Fructose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | F3627 | F6P |
| Fumarate | Sigma-Aldrich | F8509 | FUM |
| Gluconate 6-phosphate | Sigma-Aldrich | P7877 | 6PG |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | GLC |
| Glucose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | G7879 | G6P |
| Glycerol 3-phosphate | Sigma-Aldrich | G7886 | Gly3P |
| Guanosine diphosphate | Sigma-Aldrich | G7127 | GDP |
| Guanosine monophosphate | Sigma-Aldrich | G8377 | GMP |
| Guanosine triphosphate | Sigma-Aldrich | G8877 | GTP |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | HCl |
| Isocitrate | Sigma-Aldrich | I1252 | ICIT |
| Lactate | Sigma-Aldrich | L1750 | LAC |
| Malate | Sigma-Aldrich | 02288 | MAL |
| myTXTL – Sigma 70 Master Mix Kit | ArborBiosciences | 507024 | Cell-free protein synthesis |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 | EDC |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | 43410 | NAD |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | Sigma-Aldrich | N5755 | NADP |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced | Sigma-Aldrich | 481973 | NADPH |
| Nicotinamide adenine dinucleotide reduced | Sigma-Aldrich | N8129 | NADH |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | OAA |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma-Aldrich | P0564 | PEP |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | PYR |
| Ribose 5-phosphate | Sigma-Aldrich | R7750 | R5P |
| Ribulose 5-phosphate | CarboSynth | MR45852 | RL5P |
| Sedoheptulose 7-phosphate | CarboSynth | MS07457 | S7P |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S3674 | SUCC |
| Tributylamine | Sigma-Aldrich | 90780 | TBA |
| Triethylamine | FisherScientific | O4884 | TEA |
| ultrapure water | FisherScientific | 10977-015 | water |
| Uridine diphosphate | Sigma-Aldrich | U4125 | UDP |
| Uridine monophosphate | Sigma-Aldrich | U6375 | UMP |
| Uridine triphosphate | Sigma-Aldrich | U6625 | UTP |
| VWR Heavy Duty Vortex | VWR | Vortex | |
| Water, LCMS | JT BAKER | 9831-03 | WATER |
| Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity Qda detector | Waters | LCMS | |
| Waters Empower 3 | Waters | Software | |
| Waters LCMS Total Recovery Vial | Waters | 186000384c | LCMS Vial |
Riferimenti
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