Quantificazione assoluta del metabolismo della sintesi proteica senza cellule da demografia-cromometria di massa a fase reverse
Summary
Qui, presentiamo un protocollo robusto per quantificare 40 composti coinvolti nel metabolismo centrale del carbonio e dell’energia nelle reazioni di sintesi proteica priva di cellule. La miscela di sintesi senza cellule viene derivata con un’anilina per una separazione efficace utilizzando la cromatografia liquida a fase invertita e quindi quantificata dalla spettrometria di massa utilizzando standard interni etichettati isotopicamente.
Abstract
La sintesi delle proteine prive di cellule (CFPS) è una tecnologia emergente nei sistemi e nella biologia sintetica per la produzione in vitro di proteine. Tuttavia, se CFPS sta per andare oltre il laboratorio e diventare una tecnologia di produzione diffusa e standard just in time, dobbiamo capire i limiti di prestazioni di questi sistemi. A questa domanda, abbiamo sviluppato un protocollo robusto per quantificare 40 composti coinvolti nella glicolisi, la via del fosfato della pentosi, il ciclo dell’acido tricarboxillico, il metabolismo energetico e la rigenerazione del cofattore nelle reazioni CFPS. Il metodo utilizza standard interni contrassegnati con 13C-anilina, mentre i composti nel campione vengono derivati con 12C-anilina. Gli standard e il campione interni sono stati miscelati e analizzati mediante spettrometria cromatografia-massa liquida in fase invertita (LC/MS). La co-eluzione dei composti ha eliminato la soppressione degli ioni, consentendo la quantificazione accurata delle concentrazioni di metaboliti su 2-3 ordini di grandezza dove il coefficiente di correlazione medio era 0,988. Cinque dei quaranta composti sono stati senza tag con anilina, tuttavia, sono stati ancora rilevati nel campione CFPS e quantificati con un metodo di curva standard. La corsa cromatica richiede circa 10 minuti per essere completata. Nel loro insieme, abbiamo sviluppato un metodo veloce e robusto per separare e quantificare con precisione 40 composti coinvolti nella CFPS in un’unica corsa LC/MS. Il metodo è un approccio completo e preciso per caratterizzare il metabolismo privo di cellule, in modo che in ultima analisi, possiamo comprendere e migliorare la resa, la produttività e l’efficienza energetica dei sistemi senza cellule.
Introduction
La sintesi delle proteine prive di cellule (CFPS) è una piattaforma promettente per la produzione di proteine e sostanze chimiche, un’applicazione tradizionalmente riservata alle cellule viventi. I sistemi senza cellule sono derivati da estratti di cellule grezze ed eliminano le complicazioni associate alla crescita cellulare1. Inoltre, CFPS consente l’accesso diretto ai metaboliti e ai macchinari biosintetici senza l’interferenza di una parete cellulare. Tuttavia, è stata carente una comprensione fondamentale dei limiti di prestazioni dei processi senza cellule. I metodi ad alta produttività per la quantificazione dei metaboliti sono preziosi per la caratterizzazione del metabolismo e sono fondamentali per la costruzione di modelli metabolici computazionali2,3,4. I metodi più comuni utilizzati per determinare le concentrazioni di metaboliti includono la risonanza magnetica nucleare (NMR), la spettroscopia a infrarossi a infrarossi di Fourier (FT-IR), i saggi basati su enzimi e la spettrometria di massa (MS)5,6,7 ,8. Tuttavia, questi metodi sono spesso limitati dalla loro incapacità di misurare in modo efficiente più composti contemporaneamente e spesso richiedono una dimensione del campione maggiore rispetto alle tipiche reazioni senza cellule. Ad esempio, i saggi basati su enzimi spesso possono essere utilizzati solo per quantificare un singolo composto in una corsa e sono limitati quando la dimensione del campione è piccola, ad esempio nelle reazioni di sintesi proteica priva di cellule (tipicamente eseguite su una scala 10-15). Nel frattempo, NMR richiede un’elevata abbondanza di metaboliti per il rilevamento e la quantificazione5. Verso queste carenze, i metodi di cromatografia in tandem con la spettrometria di massa (LC/MS) offrono diversi vantaggi, tra cui l’elevata sensibilità e la capacità di misurare più specie contemporaneamente9; tuttavia, la complessità analitica aumenta considerevolmente con il numero e la diversità delle specie misurate. È quindi importante sviluppare metodi in grado di realizzare appieno il potenziale ad alta produttività dei sistemi LC/MS. I composti in un campione sono separati dalla cromatografia liquida e identificati attraverso la spettrometria di massa. Il segnale del composto dipende dalla sua efficienza di concentrazione e ionizzazione, dove la ionizzazione può variare tra i composti e può anche dipendere dalla matrice del campione.
Raggiungere la stessa efficienza di ionizzazione tra il campione e gli standard è una sfida quando si utilizza LC/MS per quantificare gli analiti. Inoltre, la quantificazione diventa più impegnativa con la diversità dei metaboliti a causa della divisione del segnale e dell’eterogeneità nell’affinità protonica e nella polarità10. Infine, la matrice di co-eluting del campione può anche influenzare l’efficienza della ionizzazione dei composti. Per risolvere questi problemi, i metaboliti possono essere derivati chimicamente, aumentando la risoluzione di separazione e la sensibilità da parte dei sistemi LC/MS, riducendo contemporaneamente la suddivisione del segnale in alcuni casi10,11. La derivazione chimica funziona etichettando specifici gruppi funzionali di metaboliti per regolare le loro proprietà fisiche come carica o idrofobicità per aumentare l’efficienza di ionizzazione11. Vari agenti di etichettatura possono essere utilizzati per indirizzare diversi gruppi funzionali (ad esempio, ammine, idrossidi, fosfati, acidi carboxylici, ecc.). Aniline, uno di questi agenti di derivazione, si rivolge a più gruppi funzionali contemporaneamente, e aggiunge un componente idrofobico in molecole idrofile, aumentando così la loro risoluzione di separazione e il segnale12. Per affrontare l’effetto di soppressione degli ioni a matrice co-elutazione, Yang e i colleghi hanno sviluppato una tecnica basata sull’etichettatura GSIST (Group Specific Internal Standard Technology) in cui gli standard sono contrassegnati con isotopi di anilinea 13C e mescolati con il campione 12,13. Il metabolita e il corrispondente standard interno hanno la stessa efficienza di ionizzazione dal momento che co-eluito, e il loro rapporto di intensità può essere utilizzato per quantificare la concentrazione nel campione sperimentale.
In questo studio, abbiamo sviluppato un protocollo per rilevare e quantificare 40 composti coinvolti nella glicolisi, la via del fosfato pentosi, il ciclo dell’acido tricarboxyillico, il metabolismo energetico e la rigenerazione del cofattore nelle reazioni CFPS. Il metodo si basa sull’approccio GSIST, dove abbiamo usato 12C-anilina e 13C-anilina per etichettare, rilevare e quantificare i metaboliti utilizzando LC/MS in fase invertita. La gamma lineare di tutti i composti si estendeva su 2-3 ordini di grandezza con un coefficiente di correlazione medio di 0,988. Così, il metodo è un approccio robusto e preciso per interrogare il metabolismo senza cellule, e possibilmente estratti interi cellulari.
Protocol
Representative Results
Discussion
I sistemi privi di cellule non hanno una parete cellulare, quindi c’è accesso diretto ai metaboliti e ai macchinari biosintetici senza la necessità di una complessa preparazione del campione. Tuttavia, è stato fatto molto poco lavoro per sviluppare protocolli approfonditi e robusti per interrogare quantitativamente sistemi di reazione privi di cellule. In questo studio, abbiamo sviluppato un metodo veloce e robusto per quantificare i metaboliti nelle miscele di reazione prive di cellule e potenzialmente in estratti in…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro descritto è stato supportato dal Centro sulla Fisica del Metabolismo del Cancro attraverso il premio numero 1U54CA210184-01 del National Cancer Institute (https://www.cancer.gov/ ). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Cancer Institute o dei National Institutes of Health. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell’analisi dei dati, nella decisione di pubblicazione o nella preparazione del manoscritto.
Materials
| 12C Aniline | Sigma-Aldrich | 242284 | Aniline 12C |
| 13C labeled aniline | Sigma-Aldrich | 485797 | Aniline 13C6 |
| 3-Phosphoglyceric acid | Sigma-Aldrich | P8877 | 3PG |
| Acetic Acid | FisherScientific | AC222140010 | ACE |
| Acetonitrile, LCMS | JT BAKER | 9829-03 | ACN |
| Acetyl-coenzyme A | Sigma-Aldrich | A2056 | ACA |
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM, 2.1 x 150 mm Column | Waters | 186002353 | Column |
| Adenosine diphosphate | Sigma-Aldrich | A2754 | ADP |
| Adenosine monophosphate | Sigma-Aldrich | A1752 | AMP |
| Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A2383 | ATP |
| Alpha-ketoglutarate | Sigma-Aldrich | K1128 | aKG |
| Citrate | Sigma-Aldrich | 251275 | CIT |
| Cytidine diphosphate | Sigma-Aldrich | C9755 | CDP |
| Cytidine monophosphate | Sigma-Aldrich | C1006 | CMP |
| Cytidine triphosphate | Sigma-Aldrich | C9274 | CTP |
| D-glyceraldehyde 3-phosphate | Sigma-Aldrich | 39705 | GAP |
| Erythrose 4-phosphate | Sigma-Aldrich | E0377 | E4P |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | EX0276 | EtOH |
| Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge | FisherScientific | Centrifuge | |
| Flavin adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | F6625 | FAD |
| Fructose 1,6-bisphosphate | Sigma-Aldrich | F6803 | F16P |
| Fructose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | F3627 | F6P |
| Fumarate | Sigma-Aldrich | F8509 | FUM |
| Gluconate 6-phosphate | Sigma-Aldrich | P7877 | 6PG |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | GLC |
| Glucose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | G7879 | G6P |
| Glycerol 3-phosphate | Sigma-Aldrich | G7886 | Gly3P |
| Guanosine diphosphate | Sigma-Aldrich | G7127 | GDP |
| Guanosine monophosphate | Sigma-Aldrich | G8377 | GMP |
| Guanosine triphosphate | Sigma-Aldrich | G8877 | GTP |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | HCl |
| Isocitrate | Sigma-Aldrich | I1252 | ICIT |
| Lactate | Sigma-Aldrich | L1750 | LAC |
| Malate | Sigma-Aldrich | 02288 | MAL |
| myTXTL – Sigma 70 Master Mix Kit | ArborBiosciences | 507024 | Cell-free protein synthesis |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 | EDC |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | 43410 | NAD |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | Sigma-Aldrich | N5755 | NADP |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced | Sigma-Aldrich | 481973 | NADPH |
| Nicotinamide adenine dinucleotide reduced | Sigma-Aldrich | N8129 | NADH |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | OAA |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma-Aldrich | P0564 | PEP |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | PYR |
| Ribose 5-phosphate | Sigma-Aldrich | R7750 | R5P |
| Ribulose 5-phosphate | CarboSynth | MR45852 | RL5P |
| Sedoheptulose 7-phosphate | CarboSynth | MS07457 | S7P |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S3674 | SUCC |
| Tributylamine | Sigma-Aldrich | 90780 | TBA |
| Triethylamine | FisherScientific | O4884 | TEA |
| ultrapure water | FisherScientific | 10977-015 | water |
| Uridine diphosphate | Sigma-Aldrich | U4125 | UDP |
| Uridine monophosphate | Sigma-Aldrich | U6375 | UMP |
| Uridine triphosphate | Sigma-Aldrich | U6625 | UTP |
| VWR Heavy Duty Vortex | VWR | Vortex | |
| Water, LCMS | JT BAKER | 9831-03 | WATER |
| Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity Qda detector | Waters | LCMS | |
| Waters Empower 3 | Waters | Software | |
| Waters LCMS Total Recovery Vial | Waters | 186000384c | LCMS Vial |
Riferimenti
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