Quantificação absoluta do metabolismo da síntese de proteínas livres de células por cromatografia líquida de fase reversa-espectrometria
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo robusto para quantificar 40 compostos envolvidos no metabolismo central de carbono e energia em reações de síntese de proteínas livres de células. A mistura de síntese livre de células é derivada com aniline para separação eficaz usando cromatografia líquida de fase invertida e, em seguida, quantificada pela espectrometria de massa usando padrões internos isotópicos rotulados.
Abstract
A síntese de proteínas livres de células (CFPS) é uma tecnologia emergente em sistemas e biologia sintética para a produção in vitro de proteínas. No entanto, se cfps vai ir além do laboratório e se tornar um padrão generalizado e apenas no tempo de fabricação de tecnologia, temos de compreender os limites de desempenho desses sistemas. Em relação a essa questão, desenvolvemos um protocolo robusto para quantificar 40 compostos envolvidos na glicolíse, a via de fosfato de pentose, o ciclo de ácido tricarboxílico, o metabolismo energético e a regeneração do cofator nas reações da CFPS. O método utiliza padrões internos marcados com 13C-aniline, enquanto os compostos na amostra são derivados com 12C-aniline. Os padrões internos e a amostra foram mistos e analisados por cromatografia líquida de fase invertida-espectrometria de massa (LC/MS). A co-elução de compostos eliminou a supressão de íons, permitindo a quantificação precisa de concentrações de metabolizados em 2-3 ordens de magnitude, onde o coeficiente de correlação média foi de 0,988. Cinco dos quarenta compostos não foram marcados com aniline, entretanto, foram detectados ainda na amostra de CFPS e quantificados com um método padrão da curva. A corrida cromatográfica leva aproximadamente 10 min para ser concluída. Em conjunto, desenvolvemos um método rápido e robusto para separar e quantificar com precisão 40 compostos envolvidos no CFPS em uma única execução lc/ms. O método é uma abordagem abrangente e precisa para caracterizar o metabolismo livre de células, de modo que, em última análise, podemos entender e melhorar o rendimento, produtividade e eficiência energética dos sistemas livres de células.
Introduction
A síntese de proteínas livres de células (CFPS) é uma plataforma promissora para a fabricação de proteínas e produtos químicos, uma aplicação que tradicionalmente tem sido reservada para células vivas. Sistemas livres de células são derivados de extratos de células brutas e eliminar as complicações associadas com o crescimento celular1. Além disso, o CFPS permite o acesso direto aos metabólitos e às máquinas biossintéticas sem a interferência de uma parede celular. No entanto, tem faltado uma compreensão fundamental dos limites de desempenho dos processos livres de células. Métodos de alta taxa de produção para quantificação de metabólitos são valiosos para a caracterização do metabolismo e são fundamentais para a construção de modelos computacionais metabólicos2,3,4. Os métodos comuns usados para determinar concentrações de metabolizados incluem ressonância magnética nuclear (RM), espectroscopia transformo-infravermelha de Fourier (FT-IR), ensaios baseados em enzimas e espectrometria de massa (MS)5,6,7 8. No entanto, estes métodos são muitas vezes limitados pela sua incapacidade de medir eficientemente vários compostos de uma só vez e muitas vezes exigem um tamanho amostral maior do que as reações típicas livres de células. Por exemplo, ensaios baseados em enzimas muitas vezes só podem ser usados para quantificar um único composto em uma corrida, e são limitados quando o tamanho da amostra é pequeno, como em reações de síntese de proteínas livres de células (normalmente executado em uma escala de 10-15 μL). Enquanto isso, nmr requer uma alta abundância de metabólitos para detecção e quantificação5. Para essas deficiências, os métodos de cromatografia em conjunto com a espectrometria de massa (LC/MS) fornecem várias vantagens, incluindo alta sensibilidade e a capacidade de medir várias espécies simultaneamente9; no entanto, a complexidade analítica aumenta consideravelmente com o número e a diversidade de espécies sendo medidos. É importante, portanto, desenvolver métodos que realizem plenamente o potencial de alta taxa de veiviação dos sistemas LC/MS. Os compostos em uma amostra são separados pela cromatografia líquida e identificados através da espectrometria de massa. O sinal do composto depende de sua eficiência de concentração e ionização, onde a ionização pode variar entre compostos e também pode depender da matriz da amostra.
Alcançar a mesma eficiência de ionização entre a amostra e os padrões é um desafio ao usar LC/MS para quantificar os analitos. Além disso, a quantificação torna-se mais desafiadora com a diversidade de metabólitos devido à divisão de sinais e heterogeneidade na afinidade e polaridade de prótons10. Por fim, a matriz de co-eluting da amostra também pode afetar a eficiência de ionização dos compostos. Para resolver esses problemas, os metabólitos podem ser quimicamente derivatizados, aumentando a resolução e sensibilidade de separação por sistemas LC/MS, ao mesmo tempo em que diminuem a divisão de sinais em alguns casos10,11. A derivatização química funciona marcando grupos funcionais específicos de metabólitos para ajustar suas propriedades físicas, como carga ou hidrofóbica, para aumentar a eficiência de ionização11. Vários agentes de marcação podem ser usados para atingir diferentes grupos funcionais (por exemplo, aminas, hidroxils, fosfatos, ácidos carboxílicos, etc.). Aniline, um tal agente de derivatização, tem como alvo vários grupos funcionais ao mesmo tempo, e adiciona um componente hidrofóbico em moléculas hidrofílicas, aumentando assim a sua resolução de separação e sinal12. Para abordar o efeito de supressão de íons de matriz cooperativa, Yang e colegas de trabalho desenvolveram uma técnica baseada na rotulagem da Tecnologia De Padrão Interno Específico do Grupo (GSIST), onde os padrões são marcados com isótopos aniline 13C e misturados com a amostra 12,13. O metabolito e o padrão interno correspondente têm a mesma eficiência de ionização desde que co-elute, e sua razão de intensidade pode ser usada para quantificar a concentração na amostra experimental.
Neste estudo, desenvolvemos um protocolo para detectar e quantificar 40 compostos envolvidos na glicolíse, a via de fosfato de pentose, o ciclo de ácido tricarboxílico, metabolismo energético e regeneração de cofator em reações de CFPS. O método é baseado na abordagem GSIST, onde usamos 12C-aniline e 13C-aniline para marcar, detectar e quantificar metabólitos usando LC/MS de fase invertida. A escala linear de todos os compostos mediu 2-3 ordens do valor com um coeficiente médio da correlação de 0.988. Assim, o método é uma abordagem robusta e precisa para interrogar o metabolismo livre de células e, possivelmente, extratos de células inteiras.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os sistemas livres de células não têm parede celular, portanto, há acesso direto a metabólitos e as máquinas biossintéticas sem a necessidade de preparação complexa da amostra. No entanto, muito pouco trabalho tem sido feito para desenvolver protocolos completos e robustos para interrogar quantitativamente sistemas de reação livres de células. Neste estudo, desenvolvemos um método rápido e robusto para quantificar metabólitos em misturas de reação livre de células e potencialmente em extratos de célula…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho descrito foi apoiado pelo Centro de Física do Metabolismo do Câncer através do Prêmio Número 1U54CA210184-01 do Instituto Nacional do Câncer (https://www.cancer.gov/). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional do Câncer ou dos Institutos Nacionais de Saúde. Os financiadores não tiveram nenhum papel no projeto do estudo, na coleta e na análise de dados, na decisão de publicar ou na preparação do manuscrito.
Materials
| 12C Aniline | Sigma-Aldrich | 242284 | Aniline 12C |
| 13C labeled aniline | Sigma-Aldrich | 485797 | Aniline 13C6 |
| 3-Phosphoglyceric acid | Sigma-Aldrich | P8877 | 3PG |
| Acetic Acid | FisherScientific | AC222140010 | ACE |
| Acetonitrile, LCMS | JT BAKER | 9829-03 | ACN |
| Acetyl-coenzyme A | Sigma-Aldrich | A2056 | ACA |
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM, 2.1 x 150 mm Column | Waters | 186002353 | Column |
| Adenosine diphosphate | Sigma-Aldrich | A2754 | ADP |
| Adenosine monophosphate | Sigma-Aldrich | A1752 | AMP |
| Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A2383 | ATP |
| Alpha-ketoglutarate | Sigma-Aldrich | K1128 | aKG |
| Citrate | Sigma-Aldrich | 251275 | CIT |
| Cytidine diphosphate | Sigma-Aldrich | C9755 | CDP |
| Cytidine monophosphate | Sigma-Aldrich | C1006 | CMP |
| Cytidine triphosphate | Sigma-Aldrich | C9274 | CTP |
| D-glyceraldehyde 3-phosphate | Sigma-Aldrich | 39705 | GAP |
| Erythrose 4-phosphate | Sigma-Aldrich | E0377 | E4P |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | EX0276 | EtOH |
| Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge | FisherScientific | Centrifuge | |
| Flavin adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | F6625 | FAD |
| Fructose 1,6-bisphosphate | Sigma-Aldrich | F6803 | F16P |
| Fructose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | F3627 | F6P |
| Fumarate | Sigma-Aldrich | F8509 | FUM |
| Gluconate 6-phosphate | Sigma-Aldrich | P7877 | 6PG |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | GLC |
| Glucose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | G7879 | G6P |
| Glycerol 3-phosphate | Sigma-Aldrich | G7886 | Gly3P |
| Guanosine diphosphate | Sigma-Aldrich | G7127 | GDP |
| Guanosine monophosphate | Sigma-Aldrich | G8377 | GMP |
| Guanosine triphosphate | Sigma-Aldrich | G8877 | GTP |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | HCl |
| Isocitrate | Sigma-Aldrich | I1252 | ICIT |
| Lactate | Sigma-Aldrich | L1750 | LAC |
| Malate | Sigma-Aldrich | 02288 | MAL |
| myTXTL – Sigma 70 Master Mix Kit | ArborBiosciences | 507024 | Cell-free protein synthesis |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 | EDC |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | 43410 | NAD |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | Sigma-Aldrich | N5755 | NADP |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced | Sigma-Aldrich | 481973 | NADPH |
| Nicotinamide adenine dinucleotide reduced | Sigma-Aldrich | N8129 | NADH |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | OAA |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma-Aldrich | P0564 | PEP |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | PYR |
| Ribose 5-phosphate | Sigma-Aldrich | R7750 | R5P |
| Ribulose 5-phosphate | CarboSynth | MR45852 | RL5P |
| Sedoheptulose 7-phosphate | CarboSynth | MS07457 | S7P |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S3674 | SUCC |
| Tributylamine | Sigma-Aldrich | 90780 | TBA |
| Triethylamine | FisherScientific | O4884 | TEA |
| ultrapure water | FisherScientific | 10977-015 | water |
| Uridine diphosphate | Sigma-Aldrich | U4125 | UDP |
| Uridine monophosphate | Sigma-Aldrich | U6375 | UMP |
| Uridine triphosphate | Sigma-Aldrich | U6625 | UTP |
| VWR Heavy Duty Vortex | VWR | Vortex | |
| Water, LCMS | JT BAKER | 9831-03 | WATER |
| Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity Qda detector | Waters | LCMS | |
| Waters Empower 3 | Waters | Software | |
| Waters LCMS Total Recovery Vial | Waters | 186000384c | LCMS Vial |
Riferimenti
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