קוונפיקציה של הדבקה תא הגידול בצומת לימפה קריוסעיפים
Summary
כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה וזולה המאפשרת כימות של תאים סרטניים דבק לצומת לימפה (LN) קריודורים. In-חסיד תאים סרטניים מזוהים בקלות על ידי מיקרוסקופ אור ואישר על ידי שיטה מבוססת-פלואורסצנטית, מתן אינדקס הדבקה החושף את הזיקה של תא הגידול מחייב לתוך הכריכה.
Abstract
גידול בלוטות לימפה ניקוז (LNs) הם לא רק מסננים של פסולת המיוצר הגידול. הם אחד האתרים האזוריים הנפוצים ביותר של מגורים זמניים של תאים סרטניים המופץ בחולים עם סוגים שונים של סרטן. הזיהוי של תאים אלה המתגוררים בתוך הגידול הוא בסמנים חשובים הקשורים פרוגנוזה גרועה החלטות הטיפול הפסיקה. מודלים העכבר האחרונות הצביעו על תאים סרטניים בתוך המתגוררים יכול להיות מקור משמעותי של תאים ממאירים עבור גרורות מרוחקות. היכולת לכמת את הadהיסוס של תאי הגידול לתוך מכימומה הוא מד קריטי במחקר ניסיוני המתמקד בזיהוי של גנים או איתות מסלולים הרלוונטיים הפצת הלימפה/גרורתית. מכיוון LNs הם מבנים תלת-ממדיים מורכבים עם מגוון רחב של הופעות ויצירות בסעיפים רקמות בהתאם למישור של סעיף, מטריצות שלהם קשה לשכפל ניסויים בתוך מבחנה באופן מלא בשליטה. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה וזולה המאפשרת את הקוונפיקציה של תאים סרטניים דבק כדי בהקפאה חלקים. שימוש במקטעים סידוריים של אותו LN, אנו להתאים את השיטה הקלאסית שפותחה על ידי Brodt להשתמש בתוויות לא רדיואקטיביות ולספור ישירות את מספר תאים הגידול הקפדה על פני השטח בשטח. In-חסיד תאים סרטניים מזוהים בקלות על ידי מיקרוסקופ אור ואישר על ידי שיטה מבוססת על-ידי זריחה, מתן אינדקס הדבקה החושף את הזיקה לתא-מחייב ב-LN, אשר היא עדות מרמזת של שינויים מולקולריים באיגוד האהדה של אינטגרציה להתאים שלהם ב-ligands ליגנדס.
Introduction
גרורות סרטן היא הסיבה העיקרית לכישלון הטיפול ואת ההיבט הדומיננטי סכנת חיים של סרטן. כפי היסוד 130 לפני שנים, התפשטות גרורתית תוצאות כאשר האליטה של תאי הגידול הפיצו (DTCs, “זרעים”) לרכוש יכולות ביולוגיות ספציפיות המאפשרות להם להתחמק אתרים עיקריים ולהקים צמיחה ממאיר באתרים מרוחקים (“האדמה”)1. לאחרונה, מספר מושגים חדשניים לגבי היחסים “זרעים וקרקע” הופיעו, כגון אינדוקציה של נישות גרורתית (המשגיחה כ “אדמה פורייה” הדרושה “זרעים” כדי לשגשג), הזריעה עצמית של גידולים ראשוניים על ידי dtcs, “זרע” תרדמה באיברים משניים ומודל מתקדמות מקבילי של גרורות2.
עבור ממאירות מוצק ביותר, DTCs יכול לשכון ולהתגלות באיברים רבים mesenchymal, כגון מח עצם ובלוטות הלימפה (LNs) בחולים עם או בלי ראיות של גרורות קליני. מכיוון LNs ניקוז הגידול הם המיקום הראשון של התפשטות האזור של DTCs, במצב LN הוא אינדיקטור תחזיות חשוב והוא משויך לעיתים קרובות עם החלטות טיפול בפסיקה3. עבור חלק מסוגי הגידולים, הקורלציה בין במעמד ותוצאות גרועות יותר היא חזקה, כולל ראש וצוואר4,5, שד6, הערמונית7, ריאה8, קיבה9, המעי הגס10,11 בלוטת התריס סרטן12.
Lns הם איברים קטנים דמוי של מערכת הלימפה, כי הם מכוסים בתאים רשתית מוקף עם כלי הלימפה. איברים אלה נחוצים בהחלט לתפקוד מערכת החיסון13. LNs לפעול כפלטפורמות מושכים עבור תאים מחזורי החיסונית, להביא את לימפוציטים ו אנטיגן הצגת תאים יחד14. עם זאת, LNs גם למשוך תאים סרטניים במחזור. לאורך עשורים, LNs היו בתמונה כמסלולים פסיבי של הובלה תאים סרטניים גרורתי. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי תאים סרטניים עשוי גם להיות מונחה לכיוון LNs על ידי כימוטקטיק (נוגדנים) ו/או האפוטוטקטיק (אלמנטים מטריקס מושג) רמזים מופרש על ידי אנדותל הלימפה15. כדוגמאות, ביטוי יתר של קולטן CCR7 בתאי הגידול מקלה על ההדרכה של תאים מלנומה גרורתית לקראת הגידול-LNs מרוקן16. בנוסף, מסחטות חלבונים ב-LN לספק פיגום דבק עבור גיוס והישרדות של תאים סרטניים במחזור17. למעשה, מרוקן הגידול LNs לספק קרקע פורייה לזריעה של DTCs, אשר ניתן לשמור במדינות מתרבים או רדום על ידי מסוים בתוך אותות סביבתיים מיקרו18. גורלם הסופי של פקדי הזמן המתגוררים בעיר הוא שנוי במחלוקת; כמה עבודות מציעות כי תאים אלה הם אינדיקטורים פסיבי של התקדמות גרורתית19, בעוד אחרים מציעים כי הם בסבירות גבוהה יותר מייסדי ההתנגדות (על-ידי לזריעה עצמית אתרים ראשיים) ו/או לפעול כמאגרים סלולריים עבור גרורות (הפצת “זרעים” לצמיחת סרטן שלישוני)20,21. לאחרונה, שימוש במודלים פרה-קליניים, זה הוכיח כי חלק של אלה בתוך המתגוררים DTCs באופן פעיל הפולשים כלי הדם, נכנס למחזור הדם והכובש את הריאות21.
בהתחשב בכך נוכחות של תאים סרטניים ב LNs הוא סמן עבור תוקפנות סרטן והחלטיות, במחקר זה, אנו אופטימיזציה שיטה קלאסית שפותחה על ידי Brodt22 כדי כימות הגידול למדוד בלתי מותאם למדידת הגידולים לתאי מבחנה. השימוש בכדאיות מבוססת-פלואורסצנטית איפשר לנו לפתח פרוטוקול בעלות נמוכה, מהירה, רגישה וידידותית לסביבה (לא רדיואקטיבית) לאיתור שינויים דביקים בין תאי גידול לבין מקטעי בהקפאה. באמצעות התאים של סרטן השד MCF-7 המבטא רמות שונות של ביטוי גנים NDRG4 ועכברוש בסעיפים קפואים להדגים את השיטה, הראנו כי פרוטוקול זה איפשר מתאם טוב בין הדבקה תא הגידול כדי LNs בתוך מבחנה בתוך גרורות שנצפו בחולי סרטן השד24.
Protocol
Representative Results
Discussion
מערכת הלימפה הפצת תאים סרטניים דורש מגוון של אירועים מונחה תאים מורכבים. הם ליזום עם ניתוק התאים מהגידול העיקרי ואת שיפוץ של מטריצה החילוץ (ecm) האדריכלות, והם נתמכים על ידי כימוצ מתמשך הגירה פעילה דרך כלי לימפה lymphatics en בדרך הזקיף lns. אם תאים סרטניים לדבוק ולשרוד LNs, הם יכולים בקלות להתפשט לאי?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד ר רוסאנה דה לימה פאגאנו ואנה קרולינה Pinheiro קמפוס לסיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ: FAPESP-סאו פאולו מחקר קרן (2016/07463-4) ולודוויג המכון לחקר הסרטן (LICR).
Materials
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 352096 | |
| 2-propanol | Merck | 109634 | |
| Benchtop Laminar Flow | Esco Cell Culture | ||
| Bin for Disc | Leica | 14020139126 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100 | |
| Cell culture flask T-25 cm2 | Corning | 430372 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 UV | |
| Cryostat-Brush with magnet | Leica | 14018340426 | |
| DiIC18 Cell Traker Dye | Molecular Probes | V-22885 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 12657-029 | |
| Fluorescence microscope | Nikon Eclipse 80 | ||
| Forma Series II CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| High Profile Disposable Razor | Leica | 14035838926 | |
| Incubation Cube (IHC) | KASVI | K560030 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX31 | |
| Isofluran 100 mL | Cristália | ||
| Liquid Bloquer Super Pap Pen | Abcam, Life Science Reagents | ab2601 | |
| Optimal Cutting Temperature "OCT" compound | Sakura | 4583 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | Gibco | 31800-022 | |
| Serological Pipettes 1 mL | Jet Biofil | GSP010001 | |
| Serological Pipettes 10 mL | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Serological Pipettes 2 mL | Jet Biofil | GSP010002 | |
| Serological Pipettes 5 mL | Jet Biofil | GSP010005 | |
| Serological Pipettes 50 mL | Jet Biofil | GSP010050 | |
| Serological Pipettor Easypet 3 | Eppendorf | ||
| Tissue-Tek cryomold | Sakura | 4557 | |
| Trypan Blue 0.4% | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin | Instituto Adolfo Lutz | ATV |
Riferimenti
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer and Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
- Liu, Q., Zhang, H., Jiang, X., Qian, C., Liu, Z., Zuo, D. Factors involved in cancer metastasis: a better understanding to seed and soil hypothesis. Molecular Cancer. 16 (1), 176 (2017).
- Padera, T. P., Meijer, E. F., Munn, L. L. The Lymphatic System in Disease Processes and Cancer Progression. Annual Review of Biomedical Engineering. 18, 125-158 (2016).
- Leemans, C. R., Tiwari, R., Nauta, J. J., van der Waal, I., Snow, G. B. Regional lymph node involvement and its significance in the development of distant metastases in head and neck carcinoma. Cancer. 71 (2), 452-456 (1993).
- Kowalski, L. P., et al. Prognostic significance of the distribution of neck node metastasis from oral carcinoma. Head & Neck. 22 (3), 207-214 (2000).
- McGuire, W. L. Prognostic factors for recurrence and survival in human breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 10 (1), 5-9 (1987).
- Gervasi, L. A., et al. Prognostic significance of lymph nodal metastases in prostate cancer. The Journal of Urology. 142 (2 Pt 1), 332-336 (1989).
- Naruke, T., Suemasu, K., Ishikawa, S. Lymph node mapping and curability at various levels of metastasis in resected lung cancer. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 76 (6), 832-839 (1978).
- Sasako, M., et al. D2 lymphadenectomy alone or with para-aortic nodal dissection for gastric cancer. The New England Journal of Medicine. 359 (5), 453-462 (2008).
- Chang, G. J., Rodriguez-Bigas, M. A., Skibber, J. M., Moyer, V. A. Lymph node evaluation and survival after curative resection of colon cancer: systematic review. Journal of the National Cancer Institute. 99 (6), 433-441 (2007).
- Watanabe, T., et al. Extended lymphadenectomy and preoperative radiotherapy for lower rectal cancers. Surgery. 132 (1), 27-33 (2002).
- Machens, A., Dralle, H. Correlation between the number of lymph node metastases and lung metastasis in papillary thyroid cancer. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 97 (12), 4375-4382 (2012).
- Dijkstra, C. D., Kamperdijk, E. W. A., Veerman, A. J. P., Jones, T. C., Ward, J. M., Mohr, U., Hunt, R. D. Normal Anatomy, Histology, Immunohistology, and Ultrastructure, Lymph Node, Rat. Hemopoietic System. , 129-136 (1990).
- Gretz, J. E., Anderson, A. O., Shaw, S. Cords, channels, corridors and conduits: critical architectural elements facilitating cell interactions in the lymph node cortex. Immunological Reviews. 156, 11-24 (1997).
- Podgrabinska, S., Skobe, M. Role of lymphatic vasculature in regional and distant metastases. Microvascular Research. 95, 46-52 (2014).
- Wiley, H. E., Gonzales, E. B., Maki, W., Wu, M. T., Hwang, S. T. Expression of CC chemokine receptor-7 and regional lymph node metastasis of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 93 (21), 1638-1643 (2001).
- Chen, J., Alexander, J. S., Orr, A. W. Integrins and their extracellular matrix ligands in lymphangiogenesis and lymph node metastasis. International Journal of Cell Biology. 2012, 853703 (2012).
- Müller, M., Gounari, F., Prifti, S., Hacker, H. J., Schirrmacher, V., Khazaie, K. EblacZ tumor dormancy in bone marrow and lymph nodes: active control of proliferating tumor cells by CD8+ immune T cells. Ricerca sul cancro. 58 (23), 5439-5446 (1998).
- Cady, B. Regional lymph node metastases; a singular manifestation of the process of clinical metastases in cancer: contemporary animal research and clinical reports suggest unifying concepts. Annals of Surgical Oncology. 14 (6), 1790-1800 (2007).
- Klein, C. A. The systemic progression of human cancer: a focus on the individual disseminated cancer cell-the unit of selection. Advances in Cancer Research. 89, 35-67 (2003).
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Brodt, P. Tumor cell adhesion to frozen lymph node sections-an in vitro correlate of lymphatic metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 7 (3), 343-352 (1989).
- Badylak, S. F. Xenogeneic extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Transplant Immunology. 12 (3-4), 367-377 (2004).
- Jandrey, E. H. F., et al. NDRG4 promoter hypermethylation is a mechanistic biomarker associated with metastatic progression in breast cancer patients. NPJ Breast Cancer. 5, 11 (2019).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends in Neurosciences. 12 (9), 333 (1989).
- Costa, E. T., et al. Intratumoral heterogeneity of ADAM23 promotes tumor growth and metastasis through LGI4 and nitric oxide signals. Oncogene. 34 (10), 1270-1279 (2015).
- Song, J., et al. Extracellular matrix of secondary lymphoid organs impacts on B-cell fate and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), E2915-E2924 (2013).
- Kramer, R. H., Rosen, S. D., McDonald, K. A. Basement-membrane components associated with the extracellular matrix of the lymph node. Cell and Tissue Research. 252 (2), 367-375 (1988).
- Sobocinski, G. P., Toy, K., Bobrowski, W. F., Shaw, S., Anderson, A. O., Kaldjian, E. P. Ultrastructural localization of extracellular matrix proteins of the lymph node cortex: evidence supporting the reticular network as a pathway for lymphocyte migration. BMC Immunology. 11, 42 (2010).
- Pathak, A. P., Artemov, D., Neeman, M., Bhujwalla, Z. M. Lymph Node Metastasis in Breast Cancer Xenografts Is Associated with Increased Regions of Extravascular Drain, Lymphatic Vessel Area, and Invasive Phenotype. Ricerca sul cancro. 66 (10), 5151-5158 (2006).
