Lenf Nodu Kriyosiyonlarında Tümör Hücre Adezyonunun Ölçülmesi
Summary
Burada, lenf nodu (LN) kriyokesilere yapışkan tümör hücrelerinin sayısallaştırılmasını sağlayan basit ve ucuz bir yöntemi tanımlıyoruz. LN-yapışık tümör hücreleri ışık mikroskobu ile kolayca tanımlanır ve floresan tabanlı bir yöntemle doğrulanır, tümör hücre bağlayıcılığını LN parenkime bağlayan bir adezyon indeksi verir.
Abstract
Tümör drenaj lenf düğümleri (LNs) sadece tümör üretilen atık filtreleri değildir. Farklı kanser türlerine sahip hastalarda disemine tümör hücrelerinin geçici ikamet en yaygın bölgesel sitelerinden biridir. Bu LN-ikamet eden tümör hücrelerinin tespiti kötü prognoz ve adjuvan tedavi kararları ile ilişkili önemli bir biyobelirteçtir. Son fare modelleri LN-ikamet tümör hücrelerinin uzak metastazlar için malign hücrelerin önemli bir kaynak olabileceğini göstermiştir. Tümör hücrelerinin LN parankim’e yapışmasını ölçebilme yeteneği, genlerin tanımlanmasına veya lenfatik/metastatik yayma ile ilgili sinyal yollarına odaklanan deneysel araştırmalarda kritik bir göstergedir. LN’ler, kesit düzlemine bağlı olarak doku kesitlerinde çeşitli görünüm ve kompozisyonlara sahip karmaşık 3B yapılar olduğundan, matrislerinin deneysel olarak in vitro’yu tam kontrollü bir şekilde kopyalaması zordur. Burada, yapışkan tümör hücrelerinin LN kriyokesilerine nicelleştirilmesini sağlayan basit ve ucuz bir yöntemi tanımlıyoruz. Aynı LN’nin seri bölümlerini kullanarak Brodt tarafından geliştirilen klasik yöntemi radyoaktif olmayan etiketler kullanmak ve LN yüzey alanına göre bağlı tümör hücrelerinin sayısını doğrudan saymak için uyarlıyoruz. LN-yapışık tümör hücreleri ışık mikroskobu ile kolayca tanımlanır ve floresan tabanlı bir yöntemle doğrulanır, ln parenkim için hücre bağlayıcı lık ortaya koyan bir adezyon indeksi vererek, integrinlerin bağlaçlarına bağlanmasında moleküler değişikliklerin düşündürücü kanıtıdır.
Introduction
Kanser metastazı tedavi başarısızlığının ana nedeni ve kanserin yaşamı tehdit eden yönüdür. 130 yıl önce öne sürüldüğünde, metastatik yayılma sonuçları, yaygın tümör hücrelerinin elit (DTCs, “tohumlar”) onları birincil siteleri kaçınmak ve uzak bölgelerde kötü huylu büyüme kurmak için izin belirli biyolojik yetenekler elde (“toprak”)1. Son zamanlarda, premetastatik nişler indüksiyon (“tohum” gelişmek için gerekli bir “verimli toprak” olarak kavramsallaştırılmış), DTCs tarafından birincil tümörlerin kendi kendine tohumlama, ikincil organlarda “tohum” uykuhali ve metastazparalelilerleme modeli 2 gibi “tohum ve toprak” ilişkileri ile ilgili çeşitli yeni kavramlar ortaya çıkmıştır 2 .
Çoğu katı maligniteiçin, DTC’ler klinik metastaz bulgusu olan veya olmayan hastalarda kemik iliği ve lenf düğümleri (LN) gibi birçok mezenkimal organda bulunabilir ve saptanabilir. Tümör drenaj LNs DTCs bölgesel yayılmasının ilk yer olduğundan, LN durumu önemli bir prognostik göstergesidir ve genellikle adjuvan tedavi kararları ile ilişkilidir3. Bazı tümör tipleri için, LN durumu ve kötü sonuçlar arasındaki korelasyon güçlü, baş ve boyun dahil4,5, meme6, prostat7, akciğer8, mide9, kolorektal10,11 ve tiroid kanserleri12.
NNs retiküler hücrelerle kaplı ve lenfatik damarlar ile çevrili lenfatik sistemin küçük oval organlardır. Bu organlar kesinlikle bağışıklık sisteminin işleyişi için gereklidir13. NNs birlikte lenfositler ve antijen sunan hücreleri getirerek, bağışıklık dolaşan hücreler için çekici platformlar olarak hareket14. Ancak, LNs da dolaşan tümör hücrelerini çekmek. On yıllar boyunca, LNs metastatik tümör hücreleri için ulaşım pasif yolları olarak resmedildi. Ancak, son çalışmalar tümör hücrelerinin de kemotaktik (kemokinler) ve / veya haptotaktik (ekstrasellüler matriks elemanları) ipuçları lenfatik endotel15tarafından salgılanan lNs doğru yönlendirilmiş olabileceğini göstermiştir. Örnek olarak, tümör hücrelerinde CCR7 reseptörünün aşırı ekspresyonu tümör drenaj LNs16doğru metastatik melanom hücrelerinin rehberlik kolaylaştırır. Buna ek olarak, ekstrasellüler LN proteinleri işe alma ve dolaşım da dahil olmak üzere bir yapışkan iskele sağlamak17. Aslında, tümör drenaj LNs belirli LN mikroçevresel sinyaller18tarafından proliferatif veya atıl devletlerde muhafaza edilebilir DTCs, tohumlama için verimli toprak sağlamak. Bu LN ikamet Eden DTCs nihai kaderi tartışmalıdır; bazı çalışmalar bu hücrelerin metastatik ilerleme pasif göstergeler olduğunu düşündürmektedir19, diğerleri direnç daha olası kurucuları olduğunu düşündürmektedir (kendi kendine tohumlama birincil siteleri) ve / veya metastaziçin hücresel rezervuarlar olarak hareket (üçüncül kanser büyümesi için “tohum” yayılıyor)20,21. Son zamanlarda, preklinik modeller kullanılarak, bu LN ikamet DTCs aktif kan damarları işgal, kan dolaşımına girdi ve akciğerlerkolonize birkısmını gösterilmiştir 21 .
NNs kanser hücrelerinin varlığı kanser saldırganlık ve invazivite için bir belirteç olduğunu göz önünde bulundurarak, Bu çalışmada, biz kantitatif in IN NNs tümör hücre adezyonu ölçmek için Brodt22 tarafından geliştirilen klasik bir yöntem optimize. Floresan tabanlı bir testin kullanılması, tümör hücreleri ile LN kriyokesitleri arasındaki yapışkan değişikliklerin tespiti için düşük maliyetli, hızlı, hassas ve çevre dostu (radyoaktif olmayan) bir protokol geliştirmemize olanak sağladı. YÖNTEMe örnek vermek için NDRG4 gen ekspresyonu ve sıçan LN dondurulmuş bölümleri farklı düzeylerde ifade MCF-7 meme kanseri hücreleri kullanarak, bu protokol in vitro ve LN metastaz meme kanseri hastalarında gözlenen LN’ler için tümör hücre adezyonu arasında iyi bir korelasyon izin gösterdi24.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kanser hücrelerinin lenfatik sistem yayılması karmaşık hücre odaklı olaylar çeşitli gerektirir. Onlar primer tümör hücre ayrılması ve ekstrasellüler matriks remodeling ile başlar (ECM) mimarisi, ve kalıcı kemotaksis ve sentinel NNs yolda afferent lenfatikler aracılığıyla aktif göç tarafından desteklenir. Kanser hücreleri bağlı ve LNs hayatta, kolayca diğer ikincil organlara yayılabilir. Burada tümör hücreleri ve dondurulmuş NN’ler arasındaki özel yapışkan etkileşimlerin hızlı ve d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz teknik yardım için Dr Rosana De Lima Pagano ve Ana Carolina Pinheiro Campos teşekkür ederiz. Bu çalışma: FAPESP – São Paulo Araştırma Vakfı (2016/07463-4) ve Ludwig Kanser Araştırma Enstitüsü (LICR) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 352096 | |
| 2-propanol | Merck | 109634 | |
| Benchtop Laminar Flow | Esco Cell Culture | ||
| Bin for Disc | Leica | 14020139126 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100 | |
| Cell culture flask T-25 cm2 | Corning | 430372 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 UV | |
| Cryostat-Brush with magnet | Leica | 14018340426 | |
| DiIC18 Cell Traker Dye | Molecular Probes | V-22885 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 12657-029 | |
| Fluorescence microscope | Nikon Eclipse 80 | ||
| Forma Series II CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| High Profile Disposable Razor | Leica | 14035838926 | |
| Incubation Cube (IHC) | KASVI | K560030 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX31 | |
| Isofluran 100 mL | Cristália | ||
| Liquid Bloquer Super Pap Pen | Abcam, Life Science Reagents | ab2601 | |
| Optimal Cutting Temperature "OCT" compound | Sakura | 4583 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | Gibco | 31800-022 | |
| Serological Pipettes 1 mL | Jet Biofil | GSP010001 | |
| Serological Pipettes 10 mL | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Serological Pipettes 2 mL | Jet Biofil | GSP010002 | |
| Serological Pipettes 5 mL | Jet Biofil | GSP010005 | |
| Serological Pipettes 50 mL | Jet Biofil | GSP010050 | |
| Serological Pipettor Easypet 3 | Eppendorf | ||
| Tissue-Tek cryomold | Sakura | 4557 | |
| Trypan Blue 0.4% | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin | Instituto Adolfo Lutz | ATV |
Riferimenti
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer and Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
- Liu, Q., Zhang, H., Jiang, X., Qian, C., Liu, Z., Zuo, D. Factors involved in cancer metastasis: a better understanding to seed and soil hypothesis. Molecular Cancer. 16 (1), 176 (2017).
- Padera, T. P., Meijer, E. F., Munn, L. L. The Lymphatic System in Disease Processes and Cancer Progression. Annual Review of Biomedical Engineering. 18, 125-158 (2016).
- Leemans, C. R., Tiwari, R., Nauta, J. J., van der Waal, I., Snow, G. B. Regional lymph node involvement and its significance in the development of distant metastases in head and neck carcinoma. Cancer. 71 (2), 452-456 (1993).
- Kowalski, L. P., et al. Prognostic significance of the distribution of neck node metastasis from oral carcinoma. Head & Neck. 22 (3), 207-214 (2000).
- McGuire, W. L. Prognostic factors for recurrence and survival in human breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 10 (1), 5-9 (1987).
- Gervasi, L. A., et al. Prognostic significance of lymph nodal metastases in prostate cancer. The Journal of Urology. 142 (2 Pt 1), 332-336 (1989).
- Naruke, T., Suemasu, K., Ishikawa, S. Lymph node mapping and curability at various levels of metastasis in resected lung cancer. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 76 (6), 832-839 (1978).
- Sasako, M., et al. D2 lymphadenectomy alone or with para-aortic nodal dissection for gastric cancer. The New England Journal of Medicine. 359 (5), 453-462 (2008).
- Chang, G. J., Rodriguez-Bigas, M. A., Skibber, J. M., Moyer, V. A. Lymph node evaluation and survival after curative resection of colon cancer: systematic review. Journal of the National Cancer Institute. 99 (6), 433-441 (2007).
- Watanabe, T., et al. Extended lymphadenectomy and preoperative radiotherapy for lower rectal cancers. Surgery. 132 (1), 27-33 (2002).
- Machens, A., Dralle, H. Correlation between the number of lymph node metastases and lung metastasis in papillary thyroid cancer. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 97 (12), 4375-4382 (2012).
- Dijkstra, C. D., Kamperdijk, E. W. A., Veerman, A. J. P., Jones, T. C., Ward, J. M., Mohr, U., Hunt, R. D. Normal Anatomy, Histology, Immunohistology, and Ultrastructure, Lymph Node, Rat. Hemopoietic System. , 129-136 (1990).
- Gretz, J. E., Anderson, A. O., Shaw, S. Cords, channels, corridors and conduits: critical architectural elements facilitating cell interactions in the lymph node cortex. Immunological Reviews. 156, 11-24 (1997).
- Podgrabinska, S., Skobe, M. Role of lymphatic vasculature in regional and distant metastases. Microvascular Research. 95, 46-52 (2014).
- Wiley, H. E., Gonzales, E. B., Maki, W., Wu, M. T., Hwang, S. T. Expression of CC chemokine receptor-7 and regional lymph node metastasis of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 93 (21), 1638-1643 (2001).
- Chen, J., Alexander, J. S., Orr, A. W. Integrins and their extracellular matrix ligands in lymphangiogenesis and lymph node metastasis. International Journal of Cell Biology. 2012, 853703 (2012).
- Müller, M., Gounari, F., Prifti, S., Hacker, H. J., Schirrmacher, V., Khazaie, K. EblacZ tumor dormancy in bone marrow and lymph nodes: active control of proliferating tumor cells by CD8+ immune T cells. Ricerca sul cancro. 58 (23), 5439-5446 (1998).
- Cady, B. Regional lymph node metastases; a singular manifestation of the process of clinical metastases in cancer: contemporary animal research and clinical reports suggest unifying concepts. Annals of Surgical Oncology. 14 (6), 1790-1800 (2007).
- Klein, C. A. The systemic progression of human cancer: a focus on the individual disseminated cancer cell-the unit of selection. Advances in Cancer Research. 89, 35-67 (2003).
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Brodt, P. Tumor cell adhesion to frozen lymph node sections-an in vitro correlate of lymphatic metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 7 (3), 343-352 (1989).
- Badylak, S. F. Xenogeneic extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Transplant Immunology. 12 (3-4), 367-377 (2004).
- Jandrey, E. H. F., et al. NDRG4 promoter hypermethylation is a mechanistic biomarker associated with metastatic progression in breast cancer patients. NPJ Breast Cancer. 5, 11 (2019).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends in Neurosciences. 12 (9), 333 (1989).
- Costa, E. T., et al. Intratumoral heterogeneity of ADAM23 promotes tumor growth and metastasis through LGI4 and nitric oxide signals. Oncogene. 34 (10), 1270-1279 (2015).
- Song, J., et al. Extracellular matrix of secondary lymphoid organs impacts on B-cell fate and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), E2915-E2924 (2013).
- Kramer, R. H., Rosen, S. D., McDonald, K. A. Basement-membrane components associated with the extracellular matrix of the lymph node. Cell and Tissue Research. 252 (2), 367-375 (1988).
- Sobocinski, G. P., Toy, K., Bobrowski, W. F., Shaw, S., Anderson, A. O., Kaldjian, E. P. Ultrastructural localization of extracellular matrix proteins of the lymph node cortex: evidence supporting the reticular network as a pathway for lymphocyte migration. BMC Immunology. 11, 42 (2010).
- Pathak, A. P., Artemov, D., Neeman, M., Bhujwalla, Z. M. Lymph Node Metastasis in Breast Cancer Xenografts Is Associated with Increased Regions of Extravascular Drain, Lymphatic Vessel Area, and Invasive Phenotype. Ricerca sul cancro. 66 (10), 5151-5158 (2006).
