Количественная оценка прижатки опухолевых клеток в криосекциях лимфатических узлов
Summary
Здесь мы описываем простой и недорогой метод, который позволяет количественно количественно клеевых опухолевых клеток криосекций лимфатических узлов (LN). LN-приверженных опухолевых клеток легко идентифицируются с помощью световой микроскопии и подтверждены методом, основанным на флуоресценции, давая индекс адгезии, который показывает сродство опухолевых клеток к LN parenchyma.
Abstract
Опухолевые лимфатические узлы (ЛН) – это не просто фильтры опухолевых отходов. Они являются одним из наиболее распространенных региональных сайтов временного проживания рассеянных опухолевых клеток у пациентов с различными видами рака. Обнаружение этих LN-проживающих опухолевых клеток является важным биомаркером, связанным с плохим прогнозом и адъювантной терапии решений. Последние модели мыши показали, что LN-проживающих опухолевых клеток может быть существенным источником злокачественных клеток для далеких метастазах. Способность к количественной оценке клея опухолевых клеток к LN parenchyma является критическим датчиком в экспериментальных исследованиях, который фокусируется на выявлении генов или сигнальных путей, имеющих отношение к лимфатическому/метастатическому распространению. Поскольку LNs являются сложными 3D-структурами с различными проявлениями и композициями в секциях тканей в зависимости от плоскости секции, их матрицы трудно воспроизвести экспериментально in vitro полностью контролируемым способом. Здесь мы описываем простой и недорогой метод, который позволяет количественно йоховых опухолевых клеток в LN криосекций. Используя последовательные разделы того же LN, мы адаптируем классический метод, разработанный Бродтом, для использования нерадиоактивных меток и непосредственно подсчитываем количество примыкающих опухолевых клеток на поверхность LN. LN-приверженных опухолевых клеток легко идентифицируются с помощью световой микроскопии и подтверждаются методом, основанным на флуоресценции, давая индекс адгезии, который показывает клеточной связывания с LN parenchyma, что является наводящим свидетельством молекулярных изменений в сродстве связывания интехрин с их коррелятl LN-лигандами.
Introduction
Метастазы рака является основной причиной неудачи лечения и доминирующей опасной для жизни аспект рака. Как постулируется 130 лет назад, метастатическое распространение результатов, когда элита рассеянных опухолевых клеток (DTCs, “семена”) приобретают конкретные биологические способности, которые позволяют им уклоняться от первичных участков и установить злокачественный рост в отдаленных местах (“почва”)1. В последнее время появилось несколько новых концепций, касающихся отношений “семени и почвы”, таких как индукция преметастатических ниш (концептуальная как “плодородная почва”, необходимая для процветания “семеней”, самопосев основе первичных опухолей с помощью ДТК, “семя” в вторичных органах и параллельная модель прогрессирования метастаза2.
Для большинства твердых злокачественных новообразований, DTCs может проживать и быть обнаружены во многих мезенхимальных органов, таких как костный мозг и лимфатические узлы (ЛН) у пациентов с или без доказательств клинических метастазов. Потому что опухолевые LNs являются первым местом регионального распространения DTCs, Статус LN является важным прогностичным показателем и часто ассоциируется с адъювантной терапии решений3. Для некоторых типов опухоли, корреляция между статусом LN и худшие исходы сильна, в том числе головы и шеи4,5, грудь6, простата7, легких8, желудочный9, колоректальный10,11 и рака щитовидной железы12.
LNs являются мелкими яйцеклетки органов лимфатической системы, которые покрыты ретикулярных клеток и заключены с лимфатических сосудов. Эти органы абсолютно необходимы для функционирования иммунной системы13. LNs выступать в качестве привлекательных платформ для иммунных циркулирующих клеток, в результате чего лимфоциты и антиген-представления клеток вместе14. Тем не менее, LNs также привлекают циркулирующие опухолевые клетки. На протяжении десятилетий, LNs были изображены как пассивные маршруты транспортировки для метастатических опухолевых клеток. Тем не менее, недавние исследования показали, что опухолевые клетки могут также направляться к LNs хемотаксией (хемокины) и/или гатотактическими (внеклеточными матричными элементами) сигналами, выделяемыми лимфатическим эндотелием15. В качестве примеров, переэкспрессия рецептора CCR7 в опухолевых клетках облегчает руководство метастатическими клетками меланомы к опухолево-дренажным LNs16. Кроме того, внеклеточные белки LN обеспечивают клеевую эшафот для набора и выживания циркулирующих опухолевых клеток17. В самом деле, опухолевые LNs обеспечивают плодородную почву для посева DTCs, которые могут быть сохранены в пролиферирующих или спящих состояний по конкретным LN микроэкологических сигналов18. Окончательная судьба этих LN-проживающих DTCs является спорным; некоторые работы предполагают, что эти клетки являются пассивными показателями метастатического прогрессирования19, в то время как другие предполагают, что они, скорее всего, основатели сопротивления (путем самостоятельного посева первичных сайтов) и / или выступать в качестве клеточных резервуаров для метастазах (распространение “семена” для роста третичного рака)20,21. В последнее время, используя доклинические модели, было продемонстрировано, что часть этих LN-проживающих DTCs активно вторглись кровеносные сосуды, вошел в кровообращение и колонизировал легкие21.
Учитывая, что наличие раковых клеток в LNs является маркером для агрессивности рака и инвазивности, в этом исследовании, мы оптимизировали классический метод, разработанный Brodt22 для количественного измерения опухолевых клеток адгезии для LNs in vitro. Использование флуоресценции на основе асссе позволило нам разработать недорогой, быстрый, чувствительный и экологически чистый (нерадиоактивный) протокол для обнаружения клеевых изменений между опухолевыми клетками и LN криосекций. Использование MCF-7 раковых клеток молочной железы, выражающих различные уровни экспрессии гена NDRG4 и крысl LN замороженных разделов для примера метода, мы показали, что этот протокол позволил хорошую корреляцию между опухолевой клетки адгезии к LNs in vitro и LN метастазировать наблюдается у больных раком молочной железы24.
Protocol
Representative Results
Discussion
Распространение лимфатических систем раковых клеток требует различных сложных клеточных событий. Они инициируются с отслоение клеток от первичной опухоли и ремоделирования внеклеточной матрицы (ECM) архитектуры, и поддерживаются стойкими хемотаксиса и активной миграции через аффере?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-ра Розану Де Лима Пагано и Ана Каролина Пинейро Кампос за техническую помощь. Эта работа была поддержана грантами от: FAPESP – Сан-Паулу исследовательский фонд (2016/07463-4) и Людвиг Институт исследований рака (LICR).
Materials
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 352096 | |
| 2-propanol | Merck | 109634 | |
| Benchtop Laminar Flow | Esco Cell Culture | ||
| Bin for Disc | Leica | 14020139126 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100 | |
| Cell culture flask T-25 cm2 | Corning | 430372 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 UV | |
| Cryostat-Brush with magnet | Leica | 14018340426 | |
| DiIC18 Cell Traker Dye | Molecular Probes | V-22885 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 12657-029 | |
| Fluorescence microscope | Nikon Eclipse 80 | ||
| Forma Series II CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| High Profile Disposable Razor | Leica | 14035838926 | |
| Incubation Cube (IHC) | KASVI | K560030 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX31 | |
| Isofluran 100 mL | Cristália | ||
| Liquid Bloquer Super Pap Pen | Abcam, Life Science Reagents | ab2601 | |
| Optimal Cutting Temperature "OCT" compound | Sakura | 4583 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | Gibco | 31800-022 | |
| Serological Pipettes 1 mL | Jet Biofil | GSP010001 | |
| Serological Pipettes 10 mL | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Serological Pipettes 2 mL | Jet Biofil | GSP010002 | |
| Serological Pipettes 5 mL | Jet Biofil | GSP010005 | |
| Serological Pipettes 50 mL | Jet Biofil | GSP010050 | |
| Serological Pipettor Easypet 3 | Eppendorf | ||
| Tissue-Tek cryomold | Sakura | 4557 | |
| Trypan Blue 0.4% | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin | Instituto Adolfo Lutz | ATV |
Riferimenti
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer and Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
- Liu, Q., Zhang, H., Jiang, X., Qian, C., Liu, Z., Zuo, D. Factors involved in cancer metastasis: a better understanding to seed and soil hypothesis. Molecular Cancer. 16 (1), 176 (2017).
- Padera, T. P., Meijer, E. F., Munn, L. L. The Lymphatic System in Disease Processes and Cancer Progression. Annual Review of Biomedical Engineering. 18, 125-158 (2016).
- Leemans, C. R., Tiwari, R., Nauta, J. J., van der Waal, I., Snow, G. B. Regional lymph node involvement and its significance in the development of distant metastases in head and neck carcinoma. Cancer. 71 (2), 452-456 (1993).
- Kowalski, L. P., et al. Prognostic significance of the distribution of neck node metastasis from oral carcinoma. Head & Neck. 22 (3), 207-214 (2000).
- McGuire, W. L. Prognostic factors for recurrence and survival in human breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 10 (1), 5-9 (1987).
- Gervasi, L. A., et al. Prognostic significance of lymph nodal metastases in prostate cancer. The Journal of Urology. 142 (2 Pt 1), 332-336 (1989).
- Naruke, T., Suemasu, K., Ishikawa, S. Lymph node mapping and curability at various levels of metastasis in resected lung cancer. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 76 (6), 832-839 (1978).
- Sasako, M., et al. D2 lymphadenectomy alone or with para-aortic nodal dissection for gastric cancer. The New England Journal of Medicine. 359 (5), 453-462 (2008).
- Chang, G. J., Rodriguez-Bigas, M. A., Skibber, J. M., Moyer, V. A. Lymph node evaluation and survival after curative resection of colon cancer: systematic review. Journal of the National Cancer Institute. 99 (6), 433-441 (2007).
- Watanabe, T., et al. Extended lymphadenectomy and preoperative radiotherapy for lower rectal cancers. Surgery. 132 (1), 27-33 (2002).
- Machens, A., Dralle, H. Correlation between the number of lymph node metastases and lung metastasis in papillary thyroid cancer. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 97 (12), 4375-4382 (2012).
- Dijkstra, C. D., Kamperdijk, E. W. A., Veerman, A. J. P., Jones, T. C., Ward, J. M., Mohr, U., Hunt, R. D. Normal Anatomy, Histology, Immunohistology, and Ultrastructure, Lymph Node, Rat. Hemopoietic System. , 129-136 (1990).
- Gretz, J. E., Anderson, A. O., Shaw, S. Cords, channels, corridors and conduits: critical architectural elements facilitating cell interactions in the lymph node cortex. Immunological Reviews. 156, 11-24 (1997).
- Podgrabinska, S., Skobe, M. Role of lymphatic vasculature in regional and distant metastases. Microvascular Research. 95, 46-52 (2014).
- Wiley, H. E., Gonzales, E. B., Maki, W., Wu, M. T., Hwang, S. T. Expression of CC chemokine receptor-7 and regional lymph node metastasis of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 93 (21), 1638-1643 (2001).
- Chen, J., Alexander, J. S., Orr, A. W. Integrins and their extracellular matrix ligands in lymphangiogenesis and lymph node metastasis. International Journal of Cell Biology. 2012, 853703 (2012).
- Müller, M., Gounari, F., Prifti, S., Hacker, H. J., Schirrmacher, V., Khazaie, K. EblacZ tumor dormancy in bone marrow and lymph nodes: active control of proliferating tumor cells by CD8+ immune T cells. Ricerca sul cancro. 58 (23), 5439-5446 (1998).
- Cady, B. Regional lymph node metastases; a singular manifestation of the process of clinical metastases in cancer: contemporary animal research and clinical reports suggest unifying concepts. Annals of Surgical Oncology. 14 (6), 1790-1800 (2007).
- Klein, C. A. The systemic progression of human cancer: a focus on the individual disseminated cancer cell-the unit of selection. Advances in Cancer Research. 89, 35-67 (2003).
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Brodt, P. Tumor cell adhesion to frozen lymph node sections-an in vitro correlate of lymphatic metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 7 (3), 343-352 (1989).
- Badylak, S. F. Xenogeneic extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Transplant Immunology. 12 (3-4), 367-377 (2004).
- Jandrey, E. H. F., et al. NDRG4 promoter hypermethylation is a mechanistic biomarker associated with metastatic progression in breast cancer patients. NPJ Breast Cancer. 5, 11 (2019).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends in Neurosciences. 12 (9), 333 (1989).
- Costa, E. T., et al. Intratumoral heterogeneity of ADAM23 promotes tumor growth and metastasis through LGI4 and nitric oxide signals. Oncogene. 34 (10), 1270-1279 (2015).
- Song, J., et al. Extracellular matrix of secondary lymphoid organs impacts on B-cell fate and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), E2915-E2924 (2013).
- Kramer, R. H., Rosen, S. D., McDonald, K. A. Basement-membrane components associated with the extracellular matrix of the lymph node. Cell and Tissue Research. 252 (2), 367-375 (1988).
- Sobocinski, G. P., Toy, K., Bobrowski, W. F., Shaw, S., Anderson, A. O., Kaldjian, E. P. Ultrastructural localization of extracellular matrix proteins of the lymph node cortex: evidence supporting the reticular network as a pathway for lymphocyte migration. BMC Immunology. 11, 42 (2010).
- Pathak, A. P., Artemov, D., Neeman, M., Bhujwalla, Z. M. Lymph Node Metastasis in Breast Cancer Xenografts Is Associated with Increased Regions of Extravascular Drain, Lymphatic Vessel Area, and Invasive Phenotype. Ricerca sul cancro. 66 (10), 5151-5158 (2006).
