Cuantificación de la adhesión de células tumorales en criosecciones de nodos linfáticos
Summary
Aquí, describimos un método simple y barato que permite la cuantificación de células tumorales adhesivas a criosecciones de ganglios linfáticos (LN). Las células tumorales adsemiantes con LN se identifican fácilmente mediante microscopía de luz y se confirman mediante un método basado en fluorescencia, lo que proporciona un índice de adhesión que revela la afinidad de unión celular tumoral al parénquima LN.
Abstract
Los ganglios linfáticos que drenan tumores (LN) no son meros filtros de desechos producidos por tumores. Son uno de los sitios regionales más comunes de residencia provisional de células tumorales diseminadas en pacientes con diferentes tipos de cáncer. La detección de estas células tumorales que residen LN es un biomarcador importante asociado con malas decisiones de pronóstico y terapia adyuvante. Los modelos de ratón recientes han indicado que las células tumorales que residen LN podrían ser una fuente sustancial de células malignas para metástasis distantes. La capacidad de cuantificar la adhesividad de las células tumorales al parénquima LN es un indicador crítico en la investigación experimental que se centra en la identificación de genes o vías de señalización relevantes para la diseminación linfática/metastásica. Debido a que los LN son estructuras 3D complejas con una variedad de apariencias y composiciones en secciones de tejido dependiendo del plano de sección, sus matrices son difíciles de replicar experimentalmente in vitro de una manera totalmente controlada. Aquí, describimos un método simple y barato que permite la cuantificación de células tumorales adhesivas a criosecciones LN. Utilizando secciones seriales del mismo LN, adaptamos el método clásico desarrollado por Brodt para utilizar etiquetas no radioactivas y contar directamente el número de células tumorales adherentes por superficie LN. Las células tumorales lN-adherentes son fácilmente identificadas por microscopía de luz y confirmadas por un método basado en fluorescencia, dando un índice de adhesión que revela la afinidad de unión celular al parénquima LN, lo que es evidencia sugestiva de alteraciones moleculares en la unión de afinidad de integrinas a sus lN-ligands correlacionados.
Introduction
La metástasis del cáncer es la razón principal del fracaso del tratamiento y el aspecto dominante que pone en riesgo la vida del cáncer. Como se postuló hace 130 años, la propagación metastásica se produce cuando una élite de células tumorales diseminadas (DTCs, las “semillas”) adquieren habilidades biológicas específicas que les permiten evadir los sitios primarios y establecer un crecimiento maligno en sitios distantes (el “suelo”)1. Recientemente, han surgido varios conceptos novedosos sobre las relaciones de “semillas y suelos”, como la inducción de nichos premetastáticos (conceptualizados como un “suelo fértil” necesario para que prosperen las “semillas”), la autosiembra de tumores primarios por los TDC, la latencia “semilla” en los órganos secundarios y el modelo de progresión paralela de la metástasis2.
Para la mayoría de las neoplasias malignas sólidas, los Centros de Derechos DeN pueden residir y detectarse en muchos órganos mesenquimales, como la médula ósea y los ganglios linfáticos (LN) en pacientes con o sin evidencia de metástasis clínica. Debido a que los LN que drenan tumores son la primera ubicación de la propagación regional de los CENTROS de Libre Desarrollo, el estado del LN es un indicador de pronóstico importante y a menudo se asocia con las decisiones de terapia adyuvante3. Para algunos tipos de tumores, la correlación entre el estado de LN y los peores resultados es fuerte, incluyendo la cabeza y el cuello4,5, mama6, próstata7, pulmón8, gástrico9, colorrectal10,11 y cánceres de tiroides12.
Los LN son pequeños órganos ovoides del sistema linfático, que están cubiertos con células reticulares y encerrados con vasos linfáticos. Estos órganos son absolutamente necesarios para el funcionamiento del sistema inmunológico13. Los LN actúan como plataformas de atracción para las células circulantes inmunes, reuniendo los linfocitos y las células que presentan antígenos14. Sin embargo, los LN también atraen las células tumorales circulantes. Durante décadas, los LN fueron fotografiados como rutas pasivas de transporte para las células tumorales metastásicas. Sin embargo, estudios recientes han indicado que las células tumorales también pueden ser guiadas hacia LN por señales quimiotácticas (quimioquinas) y/o hátotácticas (elementos de matriz extracelular) secretadas por el endotelio linfático15. Como ejemplos, la sobreexpresión del receptor CCR7 en las células tumorales facilita la orientación de las células de melanoma metastásico hacia los LNs16que drenan tumores. Además, las proteínas LN extracelulares proporcionan un andamio adhesivo para el reclutamiento y la supervivencia de las células tumorales circulantes17. De hecho, los LN de drenaje de tumores proporcionan suelo fértil para la sembración de DTCs, que puede mantenerse en estados proliferativos o latentes mediante señales microambientales LN específicas18. El destino final de estos TUC que residen en el LN es controvertido; algunas obras sugieren que estas células son indicadores pasivos de progresión metastásica19, mientras que otros proponen que son más probables fundadores de la resistencia (por sitios primarios auto-siembra) y / o actúan como reservorios celulares para metástasis (difundir “semillas” para el crecimiento terciario del cáncer)20,21. Recientemente, utilizando modelos preclínicos, se ha demostrado que una fracción de estos CNL que residen invadieron activamente los vasos sanguíneos, entraron en la circulación sanguínea y colonizaron los pulmones21.
Teniendo en cuenta que la presencia de células cancerosas en los LNs es un marcador de agresividad e invasividad del cáncer, en este estudio, optimizamos un método clásico desarrollado por Brodt22 para medir cuantitativamente la adhesión de células tumorales a Los LN in vitro. El uso de un ensayo basado en la fluorescencia nos permitió desarrollar un protocolo de bajo costo, rápido, sensible y respetuoso con el medio ambiente (no radioactivo) para la detección de alteraciones adhesivas entre células tumorales y criosecciones LN. Utilizando las células de cáncer de mama MCF-7 que expresan diferentes niveles de expresión génica NDRG4 y secciones congeladas de LN de rata para ejemplificar el método, mostramos que este protocolo permitía una buena correlación entre la adhesión de las células tumorales a los LN in vitro y la metástasis LN observada en pacientes con cáncer de mama24.
Protocol
Representative Results
Discussion
La diseminación del sistema linfático de las células cancerosas requiere una variedad de eventos complejos impulsados por células. Inician con el desprendimiento celular del tumor primario y la remodelación de la arquitectura de la matriz extracelular (ECM), y están apoyados por la quimiotaxis persistente y la migración activa a través de los linfáticos aferent en el camino a los LN centinelas. Si las células cancerosas se adhieren y sobreviven en los LN, pueden propagarse fácilmente a otros órganos secundari…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a la Dra. Rosana De Lima Pagano y A Ana Carolina Pinheiro Campos por su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de: FAPESP – Sao Paulo Research Foundation (2016/07463-4) y Ludwig Institute for Cancer Research (LICR).
Materials
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 352096 | |
| 2-propanol | Merck | 109634 | |
| Benchtop Laminar Flow | Esco Cell Culture | ||
| Bin for Disc | Leica | 14020139126 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100 | |
| Cell culture flask T-25 cm2 | Corning | 430372 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 UV | |
| Cryostat-Brush with magnet | Leica | 14018340426 | |
| DiIC18 Cell Traker Dye | Molecular Probes | V-22885 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 12657-029 | |
| Fluorescence microscope | Nikon Eclipse 80 | ||
| Forma Series II CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| High Profile Disposable Razor | Leica | 14035838926 | |
| Incubation Cube (IHC) | KASVI | K560030 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX31 | |
| Isofluran 100 mL | Cristália | ||
| Liquid Bloquer Super Pap Pen | Abcam, Life Science Reagents | ab2601 | |
| Optimal Cutting Temperature "OCT" compound | Sakura | 4583 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | Gibco | 31800-022 | |
| Serological Pipettes 1 mL | Jet Biofil | GSP010001 | |
| Serological Pipettes 10 mL | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Serological Pipettes 2 mL | Jet Biofil | GSP010002 | |
| Serological Pipettes 5 mL | Jet Biofil | GSP010005 | |
| Serological Pipettes 50 mL | Jet Biofil | GSP010050 | |
| Serological Pipettor Easypet 3 | Eppendorf | ||
| Tissue-Tek cryomold | Sakura | 4557 | |
| Trypan Blue 0.4% | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin | Instituto Adolfo Lutz | ATV |
Riferimenti
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer and Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
- Liu, Q., Zhang, H., Jiang, X., Qian, C., Liu, Z., Zuo, D. Factors involved in cancer metastasis: a better understanding to seed and soil hypothesis. Molecular Cancer. 16 (1), 176 (2017).
- Padera, T. P., Meijer, E. F., Munn, L. L. The Lymphatic System in Disease Processes and Cancer Progression. Annual Review of Biomedical Engineering. 18, 125-158 (2016).
- Leemans, C. R., Tiwari, R., Nauta, J. J., van der Waal, I., Snow, G. B. Regional lymph node involvement and its significance in the development of distant metastases in head and neck carcinoma. Cancer. 71 (2), 452-456 (1993).
- Kowalski, L. P., et al. Prognostic significance of the distribution of neck node metastasis from oral carcinoma. Head & Neck. 22 (3), 207-214 (2000).
- McGuire, W. L. Prognostic factors for recurrence and survival in human breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 10 (1), 5-9 (1987).
- Gervasi, L. A., et al. Prognostic significance of lymph nodal metastases in prostate cancer. The Journal of Urology. 142 (2 Pt 1), 332-336 (1989).
- Naruke, T., Suemasu, K., Ishikawa, S. Lymph node mapping and curability at various levels of metastasis in resected lung cancer. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 76 (6), 832-839 (1978).
- Sasako, M., et al. D2 lymphadenectomy alone or with para-aortic nodal dissection for gastric cancer. The New England Journal of Medicine. 359 (5), 453-462 (2008).
- Chang, G. J., Rodriguez-Bigas, M. A., Skibber, J. M., Moyer, V. A. Lymph node evaluation and survival after curative resection of colon cancer: systematic review. Journal of the National Cancer Institute. 99 (6), 433-441 (2007).
- Watanabe, T., et al. Extended lymphadenectomy and preoperative radiotherapy for lower rectal cancers. Surgery. 132 (1), 27-33 (2002).
- Machens, A., Dralle, H. Correlation between the number of lymph node metastases and lung metastasis in papillary thyroid cancer. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 97 (12), 4375-4382 (2012).
- Dijkstra, C. D., Kamperdijk, E. W. A., Veerman, A. J. P., Jones, T. C., Ward, J. M., Mohr, U., Hunt, R. D. Normal Anatomy, Histology, Immunohistology, and Ultrastructure, Lymph Node, Rat. Hemopoietic System. , 129-136 (1990).
- Gretz, J. E., Anderson, A. O., Shaw, S. Cords, channels, corridors and conduits: critical architectural elements facilitating cell interactions in the lymph node cortex. Immunological Reviews. 156, 11-24 (1997).
- Podgrabinska, S., Skobe, M. Role of lymphatic vasculature in regional and distant metastases. Microvascular Research. 95, 46-52 (2014).
- Wiley, H. E., Gonzales, E. B., Maki, W., Wu, M. T., Hwang, S. T. Expression of CC chemokine receptor-7 and regional lymph node metastasis of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 93 (21), 1638-1643 (2001).
- Chen, J., Alexander, J. S., Orr, A. W. Integrins and their extracellular matrix ligands in lymphangiogenesis and lymph node metastasis. International Journal of Cell Biology. 2012, 853703 (2012).
- Müller, M., Gounari, F., Prifti, S., Hacker, H. J., Schirrmacher, V., Khazaie, K. EblacZ tumor dormancy in bone marrow and lymph nodes: active control of proliferating tumor cells by CD8+ immune T cells. Ricerca sul cancro. 58 (23), 5439-5446 (1998).
- Cady, B. Regional lymph node metastases; a singular manifestation of the process of clinical metastases in cancer: contemporary animal research and clinical reports suggest unifying concepts. Annals of Surgical Oncology. 14 (6), 1790-1800 (2007).
- Klein, C. A. The systemic progression of human cancer: a focus on the individual disseminated cancer cell-the unit of selection. Advances in Cancer Research. 89, 35-67 (2003).
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Brodt, P. Tumor cell adhesion to frozen lymph node sections-an in vitro correlate of lymphatic metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 7 (3), 343-352 (1989).
- Badylak, S. F. Xenogeneic extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Transplant Immunology. 12 (3-4), 367-377 (2004).
- Jandrey, E. H. F., et al. NDRG4 promoter hypermethylation is a mechanistic biomarker associated with metastatic progression in breast cancer patients. NPJ Breast Cancer. 5, 11 (2019).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends in Neurosciences. 12 (9), 333 (1989).
- Costa, E. T., et al. Intratumoral heterogeneity of ADAM23 promotes tumor growth and metastasis through LGI4 and nitric oxide signals. Oncogene. 34 (10), 1270-1279 (2015).
- Song, J., et al. Extracellular matrix of secondary lymphoid organs impacts on B-cell fate and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), E2915-E2924 (2013).
- Kramer, R. H., Rosen, S. D., McDonald, K. A. Basement-membrane components associated with the extracellular matrix of the lymph node. Cell and Tissue Research. 252 (2), 367-375 (1988).
- Sobocinski, G. P., Toy, K., Bobrowski, W. F., Shaw, S., Anderson, A. O., Kaldjian, E. P. Ultrastructural localization of extracellular matrix proteins of the lymph node cortex: evidence supporting the reticular network as a pathway for lymphocyte migration. BMC Immunology. 11, 42 (2010).
- Pathak, A. P., Artemov, D., Neeman, M., Bhujwalla, Z. M. Lymph Node Metastasis in Breast Cancer Xenografts Is Associated with Increased Regions of Extravascular Drain, Lymphatic Vessel Area, and Invasive Phenotype. Ricerca sul cancro. 66 (10), 5151-5158 (2006).
