בידוד של האדם למבוגרים פיברוכדורים מעור הבטן הדור של המושרה בתאי גזע Pluriפוטנטי באמצעות שיטה שאינה משלבת

Summary

מתכנות התא מחייב הקדמה של גנים מרכזיים, אשר לווסת ולתחזק את מצב התאים pluriפוטנטי. הפרוטוקול המתואר מאפשר היווצרות של תאי גזע מושרה pluripotent iPSCs) מושבות של האדם המעטפת הגוף ללא ויראלי/שילוב שיטות אך באמצעות RNAs שאינו משתנה (ננומטר-RNAs) בשילוב עם גורמי התחמקות החיסון הפחתת מנגנוני ההגנה הסלולריים.

Abstract

כתוצאה מפגיעה בתאי גזע (iPSCs) יכולה להיחשב, עד היום, מקור מבטיח של תאים בעלי עוצמה לניהול המחלות הבלתי ניתן לטיפול כרגע, עבור החוקה והתחדשות של רקמות פצועות ולפיתוח תרופות חדשות. למרות כל היתרונות הנוגעים לשימוש ב-iPSCs, כגון הסיכון הנמוך של דחייה, הסוגיות האתיות ההפדלות, והאפשרות להשיג אותם מחולים צעירים וישנים ללא כל הבדל בפוטנציאל התכנות שלהם, בעיות להתגבר על הם עדיין רבים. למעשה, תא מתכנות שנערך עם ויראלי ושילוב וירוסים יכול לגרום לזיהומים המבוא של גנים נדרשים יכול לגרום לחוסר יציבות גנומית של תא הנמען, פגיעה בשימוש שלהם במרפאה. בפרט, יש חששות רבים לגבי השימוש ב-c-Myc גן, ידוע מספר מחקרים לפעילות מוטציה שלה ממריץ. פיברותקיעות התפתחה כאוכלוסיית התא המתאים לתיכנות מחודש של הסלולר כפי שהם קל לבודד את התרבות, הם נקצרו על ידי ניקוב העור פולשנית מינימלית. הפרוטוקול המתואר כאן מספק תיאור מפורט צעד אחר צעד של ההליך כולו, מעיבוד לדוגמה כדי להשיג תרביות תאים, בחירת ריאגנטים ואספקה, ניקוי והכנה, לתא התיכנות מראש על ידי האמצעים של מסחרי ערכת הניתנת לתיכנות מבוססת RNAs (NM-RNAs) שאינה משתנה. הערכה הניתנת לתיכנות מראש מאפשר התכנות מראש יעיל של האדם העור פיברוהפיצוץ כדי iPSCs ומושבות קטנות ניתן לראות מוקדם ככל 24 h לאחר העברה הראשון, גם עם שינויים עם הכבוד לגליון הנתונים הרגיל. הליך התיכנות מחודש המשמש בפרוטוקול זה מציע את היתרון של בטוח תכנות מחודש, ללא הסיכון של זיהומים הנגרמים על ידי נגיפי שיטות וקטורים מבוססי, מפחית את מנגנוני ההגנה הסלולרית, ומאפשר את הדור של xeno iPSCs חינם, כל תכונות קריטיות הכרחיות עבור יישומים קליניים נוספים.

Introduction

תכנות התא מייצג טכנולוגיה חדשנית להפוך כל תא הסומטיים של הגוף לתוך תא גזע pluripotent המכונה iPSC¹. האפשרות לתיכנות מחודש של תא סומטיים למבוגרים בחזרה למצב pluripotent מובחן יש להתגבר על המגבלות המוטלות על ידי זמינות העניים וסוגיות אתיות הקשורות לשימוש בתאי pluriפוטנטי, בעבר רק ללעג של עוברי אדם (תאי גזע עובריים או ESC)^2,3,4. בשנת 2006, Kazutoshi טקהאשי ושינייה יאמאנאקה ערכו מחקר חלוצי השגת ההמרה הראשונה של תאים סומטיים בוגרים מהעור לתאים בעלי עוצמה מלאכותית על ידי הוספת ארבעה גנים ספציפיים (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)⁵. שנה לאחר מכן, העבודה שנערכה במעבדה של תומסון הובילה לתכנות מחדש של תאים סומטיים לתוך iPSCs על ידי התמרה של שילוב שונה של ארבעה גנים (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)⁶.

iPSCs מציעים מספר הזדמנויות למדענים וחוקרים של תחומים שונים, כגון רפואה רגנרטיבית ופרמקולוגיה, להיות פלטפורמה מצוינת ללמוד ולטפל במחלות שונות יחד עם השתקפות genotypic של המאפיינים של המטופל שהם נגזר. השימוש ב iPSCs מספק מספר יתרונות כולל: סיכון מופחת לתגובה חיסונית בשל מקור אוטוולוגי לחלוטין של תאים; האפשרות של יצירת ספריית תאים, כלי חשוב כדי לנבא את התגובה לתרופות חדשות ואת תופעות הלוואי שלהם, כפי שהם מסוגלים ברציפות לחדש את עצמי וליצור סוגי תאים שונים; וההזדמנות לפתח גישה מותאמת אישית. למנהל התרופות^7,8,9

טכניקות מגוונות ידועות כיום, כדי לגרום לביטוי של גורמי תכנות משנה והם נכללים בשתי קטגוריות עיקריות: שיטות וקטוריות שאינן ויראליות ונגיפי^10,11,12,13. שיטות שאינן ויראליות כוללות העברה של mrna, זיהום/העברה, העברה, מיני וקטורים ו אפיזומיום ואקזומים^10,11,12,13. שיטות המבוססות על ויראלי כוללות וירוסים שאינם משתלבים, כגון אדנווירוס, וירוס סנדאי וחלבונים, ושילוב וירוסים כמו רטרווירוס ו-וירוס^10,11,12,13.

לדברי מספר מחקרים, אין הבדלים משמעותיים הבחין בין שיטות אלה במונחים של יעילות של תא מתיכנות מראש, ומכאן, הבחירה של השיטה המתאימה תלוי לחלוטין בסוג התא המשמש וביישומים הבאים של iPSCs שהתקבלו^14,15. כל השיטות שהוזכרו להראות חסרונות, למשל, וירוס סנדאי הוא יעיל בכל סוגי התאים, אבל דורש הרבה מעברים כדי להשיג iPSCs; מתכנות מראש על ידי אפיזומים מצוין עבור תאי דם, אבל צריך שינוי של תנאי התרבות הסטנדרטיים לפיברופיצוצים; השיטה מסוגלת לייצג חלופה אטרקטיבית אך מחקרים בתאי האדם עדיין מוגבלים וחלשים^10,11,12,13. אקסוזומים הם ננו-שלפוחית פיזיולוגית המופרש לתוך נוזלי הגוף בתאים. לפי המחקרים האחרונים, הם אחראים לתקשורת בין-תאית ויכולים להיות בעלי תפקיד בתהליכים ביולוגיים חשובים, כגון הפצת תאים, הגירה ובידול. אקסוזומים יכול להעביר ולהעביר mRNA ו miRNA לתאי הנמען עם מנגנון טבעי לחלוטין, כפי שהם חולקים את הרכב זהה של קרום התא¹⁶. לכן, האקסוזומים היא טכניקת הדור החדש והמבטיח לתכנות, אך הפוטנציאל שלהם לתכנות מיתכנת תאים סומטיים על-ידי תוכנם עדיין נמצא בחקירה. ויראלי וקטורים מבוססי שיטות להשתמש וירוסים שונה כדי להעביר גנים מתיכנות לתאי הנמען. טכניקה זו, למרות היעילות הגבוהה של תכנות מראש, אינו נחשב בטוח, כמו שילוב של הנגיף בתוך התא יכול להיות אחראי על זיהום, teratomas ויציבות גנומית¹⁷.

הפרוטוקול הבא כדי לייצר מושבות iPSCs משלבת את הקוקטייל התכנות של יאמאנאקה ו תומפסון והוא מבוסס על השימוש בשיטה הדורשת NM-RNAs וגורמי התחמקות החיסונית עם האפשרות לבצע את זה בתנאי xeno-חינם. הרציונל מאחורי השימוש בשיטה זו הוא להתפשט, בתוך הקהילה המדעית, פרוטוקול המאפשר תכנות מהיר, פשוט, יעיל מאוד של העור האנושי מפני הבטן לתוך iPSCs¹⁸.

היתרונות של השיטה המוצעת הם, למעשה, את קלות הביצועים ואת הזמן הקצר הדרוש כדי להשיג iPSCs. יתרה מזאת, השיטה נמנעת ממנגנוני הגנה סלולאריים והשימוש בווקטורים ויראליות, האחראים לסוגיות רלוונטיות.

ביחס לפרוטוקול הסטנדרטי, נעשו השינויים הבאים: (1) פיברולזציה שוטפת סונכרנו במעבר 4 על ידי הצבת ב 0.1% סרום עבור 48 h לפני הטריסינוניזציה; (2) הצפיפות התאית לתרבות ולנפח של ריאגנטים הותאמו לניצול על צלחת מרובת היטב של 24 שעות במקום צלחת של 6 היטב; (3) ניסוי תכנות מחודש בוצע באמצעות אינקובטור 5% CO₂ במקום אינקובטור עם אטמוספרית (21% o₂) או ארוי (5% o₂) תנאים.

Protocol

הדגימות מרקמת האדם נאספו על פי הצהרת הלסינקי תוך התבוננות בבית החולים האוניברסיטאי פדריקו II הנחיות. כל המטופלים המעורבים במחקר זה סיפק הסכמה בכתב. 1. הכנת אספקה ומדיית תרבות נקי ומאוטוקלב זוג אחד גדול של מספריים כירורגית, שתי סטים של מלקחיים עדינים, שני זוגות של מספריי?…

Representative Results

מטרת הפרוטוקול היתה לתכנת מראש את העור פיברותקיעות מבודדים מהעור הבטן באמצעות שיטה שאינה שילוב שיטת התכנות מבוסס NM-RNAs כדי לגרום לביטוי של גורמים ספציפיים. כדי להשיג מטרה זו, העור האדם פיברותקיעות היו מבודדים מתוך דגימות מהעור של חולים שעברו ניתוח טאק הבטן ו iPSCs נוצרו היכרות Oct4, Sox2, Klf4, cmyc, nan…

Discussion

iPSCs הם מתעוררים במהירות כמו המועמד התא המבטיח ביותר עבור יישומים רפואה רגנרטיבית וככלי מאוד שימושי עבור דוגמנות מחלות ובדיקות סמים^3,8. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר את הדור של iPSCs אנושי ממדגם בעל גודל של ניקוב עור ביופסיה עם הליך פשוט ויעיל שאינו דורש שום ציוד ספצ…

Materials

10 mL serological pipet	Falcon	357551	Sterile, polystyrene
100 mm plates	Falcon	351029	Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubes	Falcon	352097	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
24-well plates	Falcon	353935	Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile
25 mL serological pipet	Falcon	357525	Sterile, polystyrene
35 mm plates	Falcon	353001	Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipet	Falcon	357543	Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubes	Falcon	352098	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Gibco	12491-015	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Sigma- Aldrich	D6429-500ml	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine Serum	Sigma- Aldrich	F9665-500ml	Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma- Aldrich	H1387-1L	Powder
L-glutamine	Lonza	BE17-605E	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	INVITROGEN	13778-030	Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 °C
Matrigel	CORNING	354234	Basement Membrane Matrix, store at -20 °C. Avoid multiple freeze-thaws.
Neubauer Chamber	VWR	631-1116	Hemocytometer
NutriStem XF Culture Medium	Biological Industries	05-100-1A-500ml	Xeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 °C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 °C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles.
Opti-MEM	Gibco	31985-062-100ml	Reduced-Serum Medium; store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Penicillin and Streptomycin	Sigma- Aldrich	P4333-100ml	Store at -20 °C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Potassium Chloride	Sigma- Aldrich	P9333	Powder
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma- Aldrich	P5665	Powder
RNase-free 0.5 mL tubes	Eppendorf	H0030124537	RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNase-free 1.5 mL tubes	Eppendorf	H0030120086	RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNaseZAP	INVITROGEN	AM9780	Cleaning agent for removing RNase
Sodium Bicarbonate	Sigma- Aldrich	S5761	Powder
Sodium Chloride	Sigma- Aldrich	S7653	Powder
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma- Aldrich	94046	Powder
StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit	Reprocell	00-0076	Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 °C.
Trypsin-EDTA	Sigma- Aldrich	T4049-100ml	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles