Isolatie van volwassen menselijke dermale fibroblasten uit de buikhuid en de aanmaak van geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van een niet-integrerende methode

Summary

Celherprogrammering vereist de introductie van belangrijke genen, die de pluripotente celtoestand reguleren en onderhouden. Het protocol beschreven maakt de vorming van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) kolonies van menselijke dermale fibroblasten zonder virale/integrerende methoden, maar met behulp van niet-gemodificeerde Rna’s (NM-Rna’s) in combinatie met immuun ontduiking factoren vermindering van cellulaire afweermechanismen.

Abstract

Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) kunnen tot op heden worden beschouwd als een veelbelovende bron van pluripotente cellen voor het beheer van momenteel onbehandelbare ziekten, voor de reconstitutie en regeneratie van gewonde weefsels en voor de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen. Ondanks alle voordelen met betrekking tot het gebruik van iPSCs, zoals het lage risico van afwijzing, de verminderde ethische kwesties, en de mogelijkheid om ze te verkrijgen van zowel jonge als oude patiënten zonder enig verschil in hun herprogrammatie potentieel, problemen om te overwinnen zijn nog steeds talrijk. In feite kan het opnieuw programmeren van cellen, uitgevoerd met virale en het integreren van virussen, infecties veroorzaken en kan de introductie van vereiste genen een genomische instabiliteit van de ontvangende cel induceren, waardoor het gebruik ervan in de kliniek wordt aantasten. In het bijzonder zijn er veel zorgen over het gebruik van c-myc gen, bekend uit verschillende studies voor de mutatie-inducerende activiteit. Fibroblasten zijn ontstaan als de geschikte celpopulatie voor cellulaire herprogrammering omdat ze gemakkelijk te isoleren en cultuur en worden geoogst door een minimaal invasieve huid Punch biopsie. Het hier beschreven protocol biedt een gedetailleerde stapsgewijze beschrijving van de hele procedure, van de monsterverwerking tot het verkrijgen van celculturen, de keuze van reagentia en leveringen, de reiniging en de voorbereiding, tot de herprogrammering van de cellen door middel van een commerciële niet-gemodificeerde RNAs (NM-RNAs)-gebaseerde herprogrammeerset. De gekozen herprogrammeeringskit maakt een effectieve herprogrammering van menselijke huid fibroblast naar iPSCs mogelijk en kleine kolonies kunnen al 24 uur na de eerste transfectie worden gezien, zelfs met wijzigingen met betrekking tot het standaardgegevens blad. De herprogrammatie procedure die in dit protocol wordt gebruikt, biedt het voordeel van een veilige herprogrammering, zonder het risico van infecties veroorzaakt door op virale vectoren gebaseerde methoden, vermindert de cellulaire afweermechanismen en maakt het mogelijk om xeno-vrije iPSCs te genereren, alle kritieke functies die verplicht zijn voor verdere klinische toepassingen.

Introduction

Celherprogrammering vertegenwoordigt een nieuwe technologie om elke somatische cel van het lichaam om te zetten in een pluripotente stamcel, bekend als iPSC¹. De mogelijkheid om een volwassen somatische cel terug te herprogrammeren naar een pluripotente en ongedifferentieerde toestand heeft de grenzen overwonnen die zijn opgelegd door de slechte beschikbaarheid en ethische kwesties in verband met het gebruik van pluripotente cellen, die voorheen alleen konden worden afgeleid van menselijke embryo’s (embryonale stamcellen of ESC)^2,3,4. In 2006 voerden Kazutoshi Takahashi en Shinya Yamanaka een baanbrekend onderzoek uit om de eerste conversie van volwassen somatische cellen van de huid naar pluripotente cellen te bereiken door kunstmatig vier specifieke genen toe te voegen (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)⁵. Een jaar later leidde het werk in het laboratorium van Thomson tot de succesvolle herprogrammering van somatische cellen in iPSCs door transductie van een andere combinatie van vier genen (Oct4, Sox2, nanog, Lin28)⁶.

iPSCs bieden een aantal mogelijkheden voor wetenschappers en onderzoekers van verschillende gebieden, zoals regeneratieve geneeskunde en farmacologie, zijnde een uitstekend platform voor het bestuderen en behandelen van verschillende ziekten, samen met een genotypische reflectie van de kenmerken van de patiënt die ze zijn afgeleid van. Het gebruik van iPSCs biedt verschillende voordelen, waaronder: het verlaagde risico op immuunrespons als gevolg van een volledig autologe oorsprong van cellen; de mogelijkheid van het creëren van een celbibliotheek, een belangrijk instrument om de reactie op nieuwe drugs en hun bijwerkingen te voorspellen, als ze in staat zijn om voortdurend Self-verlengen en het genereren van verschillende celtypen; en de kans om een aangepaste aanpak voor Drug Administration^7,8,9te ontwikkelen.

Op dit moment zijn diverse technieken bekend om de expressie van de herprogrammatie factoren te induceren en ze zijn opgenomen in twee belangrijke categorieën: niet-virale en virale vector-gebaseerde methoden^10,11,12,13. Niet-virale methoden omvatten mRNA transfectie, Mirna-infectie/transfectie, piggybac, minicircle vectoren en episomale plasmiden en exosomen^10,11,12,13. Virale gebaseerde methoden omvatten niet-integrerende virussen, zoals adenovirus, Sendai virus en eiwitten, en het integreren van virussen zoals retrovirus en lentivirus^10,11,12,13.

Volgens verschillende studies, geen significante verschillen zijn opgemerkt onder deze methoden in termen van effectiviteit van celherprogrammering, vandaar, de keuze van de geschikte methode strikt afhankelijk van het gebruikte type cel en op de daaropvolgende toepassingen van de ipscs verkregen^14,15. Alle genoemde methoden vertonen nadelen, bijvoorbeeld, het Sendai-virus is effectief op alle celtypen, maar vereist veel passages om iPSCs te verkrijgen; herprogrammering door episomes is uitstekend voor bloedcellen, maar heeft behoefte aan aanpassing van de standaardcultuur omstandigheden voor fibroblasten; de piggybac-methode kan een aantrekkelijk alternatief zijn, maar studies in menselijke cellen zijn nog steeds beperkt en zwak^10,11,12,13. Exosomen zijn nano-blaasjes fysiologisch uitgescheiden in alle lichaamsvloeistoffen door cellen. Volgens recente studies zijn ze verantwoordelijk voor intercellulaire communicatie en kunnen ze een rol spelen in belangrijke biologische processen, zoals celproliferatie, migratie en differentiatie. Exosomen kunnen mRNA en miRNA transporteren en overdragen aan ontvangende cellen met een volledig natuurlijk mechanisme, omdat ze dezelfde samenstelling van het celmembraan¹⁶delen. Daarom zijn exosomen een veelbelovende nieuwe generatie techniek voor herprogrammering, maar hun potentieel om somatische cellen te herprogrammeren door hun inhoud wordt nog steeds onderzocht. Virale vectoren gebaseerde methoden gebruiken virussen aangepast om herprogrammatie genen over te brengen naar ontvangende cellen. Deze techniek, ondanks de hoge efficiëntie van herprogrammering, wordt niet als veilig beschouwd, omdat de integratie van het virus in de cel verantwoordelijk kan zijn voor infectie, teratomen en genomische instabiliteit¹⁷.

Het volgende protocol voor het genereren van iPSCs kolonies combineert de Yamanaka en Thompson’s Herprogrammeerbare cocktail en is gebaseerd op het gebruik van een methode die NM-Rna’s en immuun ontduiking factoren vereist met de mogelijkheid om het uit te voeren in xeno-vrije omstandigheden. De beweegreden achter het gebruik van deze methode is om binnen de wetenschappelijke gemeenschap een protocol te verspreiden dat een snelle, eenvoudige en zeer effectieve herprogrammering van volwassen menselijke fibroblasten uit de buikhuid in iPSCs¹⁸mogelijk maakt.

De sterke punten van de voorgestelde methode zijn in feite het gemak van prestaties en de korte tijd die nodig is om iPSCs te verkrijgen. Bovendien, de methode vermijdt cellulaire afweermechanismen en het gebruik van virale vectoren, verantwoordelijk voor relevante kwesties.

Met betrekking tot het standaardprotocol werden de volgende wijzigingen aangebracht: (1) confluente fibroblasten werden gesynchroniseerd bij passage 4 door in 0,1% serum te plaatsen voor 48 h vóór de trypsinoisatie; (2) de cellulaire dichtheid voor cultuur en het volume van de reagentia werden aangepast voor het gebruik op een 24-Well multi-well plaat in plaats van een 6-well plaat; (3) het herprogrammeeringsexperiment werd uitgevoerd met een 5% CO₂ -incubator in plaats van een incubator met atmosferische (21% o₂) of hypoxische (5% o₂) condities.

Protocol

De specimens uit menselijk weefsel werden verzameld volgens de verklaring van Helsinki met inachtneming van de richtlijnen van het universitair ziekenhuis Federico II. Alle bij deze studie betrokken patiënten hebben schriftelijke toestemming gegeven. 1. voorbereiding van benodigdheden en kweek media Reinig en autoclaaf een groot paar chirurgische schaar, twee sets van fijne Tang, twee paren van microdissecting schaar, 1 L steriele fles, 500 mL steriele fles, en een 250 mL steriele f…

Representative Results

Het doel van het protocol was om dermale fibroblasten die geïsoleerd waren van de buikhuid te herprogrammeren met behulp van niet-integrerende herprogrammeer methode op basis van NM-Rna’s om de expressie van specifieke factoren te induceren. Om dit doel te bereiken, werden menselijke dermale fibroblasten geïsoleerd van huid specimens van patiënten die een buik Tuck-operatie ondergingen en werden ipscs gegenereerd met introductie van Oct4, Sox2, Klf4, cmyc, nanog, Lin28 herprogrammeer factoren en E3-, K3-, b18-immuunon…

Discussion

ipscs zijn snel opkomende als de meest veelbelovende cel kandidaat voor regeneratieve geneeskunde toepassingen en als een enorm nuttig instrument voor ziekte modellering en drug testing^3,8. Het protocol hier gepresenteerd beschrijft de generatie van menselijke iPSCs van een monster met de grootte van een huid Punch biopsie met een eenvoudige en efficiënte procedure die geen specifieke apparatuur of eerdere ervaring met herprogrammering technologie vereist.

<…

Materials

10 mL serological pipet	Falcon	357551	Sterile, polystyrene
100 mm plates	Falcon	351029	Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubes	Falcon	352097	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
24-well plates	Falcon	353935	Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile
25 mL serological pipet	Falcon	357525	Sterile, polystyrene
35 mm plates	Falcon	353001	Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipet	Falcon	357543	Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubes	Falcon	352098	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Gibco	12491-015	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Sigma- Aldrich	D6429-500ml	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine Serum	Sigma- Aldrich	F9665-500ml	Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma- Aldrich	H1387-1L	Powder
L-glutamine	Lonza	BE17-605E	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	INVITROGEN	13778-030	Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 °C
Matrigel	CORNING	354234	Basement Membrane Matrix, store at -20 °C. Avoid multiple freeze-thaws.
Neubauer Chamber	VWR	631-1116	Hemocytometer
NutriStem XF Culture Medium	Biological Industries	05-100-1A-500ml	Xeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 °C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 °C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles.
Opti-MEM	Gibco	31985-062-100ml	Reduced-Serum Medium; store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Penicillin and Streptomycin	Sigma- Aldrich	P4333-100ml	Store at -20 °C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Potassium Chloride	Sigma- Aldrich	P9333	Powder
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma- Aldrich	P5665	Powder
RNase-free 0.5 mL tubes	Eppendorf	H0030124537	RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNase-free 1.5 mL tubes	Eppendorf	H0030120086	RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNaseZAP	INVITROGEN	AM9780	Cleaning agent for removing RNase
Sodium Bicarbonate	Sigma- Aldrich	S5761	Powder
Sodium Chloride	Sigma- Aldrich	S7653	Powder
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma- Aldrich	94046	Powder
StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit	Reprocell	00-0076	Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 °C.
Trypsin-EDTA	Sigma- Aldrich	T4049-100ml	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles