Aislamiento de fibroblastos dérmicos humanos adultos de la piel abdominal y generación de células madre pluripotentes inducidas utilizando un método no integrador

Summary

La reprogramación celular requiere la introducción de genes clave, que regulan y mantienen el estado celular pluripotente. El protocolo descrito permite la formación de colonias de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) a partir de fibroblastos dérmicos humanos sin métodos virales/integradores pero utilizando ARN no modificados (NM-RNA) combinados con factores de evasión inmune que reducen los mecanismos de defensa celular.

Abstract

Hasta la fecha se podría considerar que las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) son una fuente prometedora de células pluripotentes para el tratamiento de enfermedades no tratables, para la reconstitución y regeneración de tejidos lesionados y para el desarrollo de nuevos fármacos. A pesar de todas las ventajas relacionadas con el uso de iPSCs, como el bajo riesgo de rechazo, las menores cuestiones éticas, y la posibilidad de obtenerlas de pacientes jóvenes y viejos sin ninguna diferencia en su potencial de reprogramación, problemas para superar siguen siendo numerosos. De hecho, la reprogramación celular realizada con virus virales e integradores puede causar infecciones y la introducción de los genes requeridos puede inducir una inestabilidad genómica de la célula receptora, lo que perjudica su uso en la clínica. En particular, hay muchas preocupaciones sobre el uso del gen c-Myc, bien conocido a partir de varios estudios por su actividad inductora de mutaciones. Los fibroblastos han surgido como la población celular adecuada para la reprogramación celular, ya que son fáciles de aislar y cultivar y se cosechan mediante una biopsia de punzonado de piel mínimamente invasiva. El protocolo descrito aquí proporciona una descripción detallada paso a paso de todo el procedimiento, desde el procesamiento de muestras para obtener cultivos celulares, la elección de reactivos y suministros, la limpieza y la preparación, hasta la reprogramación celular por medio de un comercial RNA no modificado (NM-RNA) kit de reprogramación basado. El kit de reprogramación elegido permite una reprogramación efectiva del fibroblasto dérmico humano a los ISPC y se pueden ver pequeñas colonias tan pronto como 24 h después de la primera transfección, incluso con modificaciones con respecto a la hoja de datos estándar. El procedimiento de reprogramación utilizado en este protocolo ofrece la ventaja de una reprogramación segura, sin el riesgo de infecciones causadas por métodos virales basados en vectores, reduce los mecanismos de defensa celular y permite la generación de iPSC libres de xeno, todos características críticas que son obligatorias para otras aplicaciones clínicas.

Introduction

La reprogramación celular representa una tecnología novedosa para transformar cada célula somática del cuerpo en una célula madre pluripotente, conocida como iPSC¹. La posibilidad de reprogramar una célula somática adulta a un estado pluripotente e indiferenciado ha superado los límites impuestos por la escasa disponibilidad y cuestiones éticas relacionadas con el uso de células pluripotentes, antes sólo derivables de embriones humanos (células madre embrionarias o ESC)^2,3,4. En 2006, Kazutoshi Takahashi y Shinya Yamanaka llevaron a cabo un estudio pionero logrando la primera conversión de células somáticas adultas de piel en células pluripotentes mediante la adición artificial de cuatro genes específicos (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)⁵. Un año más tarde, el trabajo realizado en el laboratorio de Thomson condujo a la reprogramación exitosa de células somáticas en iPSC por transducción de una combinación diferente de cuatro genes (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)⁶.

Los iPSC ofrecen una serie de oportunidades a científicos e investigadores de diferentes campos, como la medicina regenerativa y la farmacología, siendo una excelente plataforma para estudiar y tratar diferentes enfermedades junto con un reflejo genotípico de las características del paciente del que se derivan. El uso de iPSCs proporciona varias ventajas, entre ellas: el menor riesgo de respuesta inmune debido a un origen completamente autólogo de las células; la posibilidad de crear una biblioteca de celdas, una herramienta importante para predecir la respuesta a nuevos fármacos y sus efectos secundarios, ya que son capaces de renovarse continuamente y generar diferentes tipos de células; y la oportunidad de desarrollar un enfoque personalizado para la administración de medicamentos^7,8,9.

En la actualidad se conocen diversas técnicas, para inducir la expresión de los factores de reprogramación y se incluyen en dos categorías principales: métodos no virales y virales basados en vectores^10,11,12,13. Los métodos no virales incluyen transfección de ARNm, infección/transfección de miRNA, PiggyBac, vectores de minicírculo y plásmidos episómicos y exosomas^10,11,12,13. Los métodos basados en virales incluyen virus no integradores, como Adenovirus, virus Y proteínas Sendai, e integración de virus como Retrovirus y Lentivirus^10,11,12,13.

Según varios estudios, no se han observado diferencias significativas entre estos métodos en términos de eficacia de la reprogramación celular, por lo tanto, la elección del método adecuado depende estrictamente del tipo de célula utilizado y de las aplicaciones posteriores de los iPSC^{obtenidos 14,15}. Todos los métodos mencionados muestran desventajas, por ejemplo, el virus Sendai es eficaz en todos los tipos de células, pero requiere una gran cantidad de pasajes para obtener iPSCs; la reprogramación por episomas es excelente para las células sanguíneas, pero necesita la modificación de las condiciones de cultivo estándar para los fibroblastos; el método PiggyBac podría representar una alternativa atractiva, pero los estudios en células humanas siguen siendo limitados y débiles^10,11,12,13. Los exosomas son nanovesículas fisiológicamente secretadas en todos los fluidos corporales por las células. Según estudios recientes, son responsables de la comunicación intercelular y pueden desempeñar un papel en procesos biológicos importantes, como la proliferación celular, la migración y la diferenciación. Los exosomas pueden transportar y transferir arnm y miRNA a las células receptoras con un mecanismo completamente natural, ya que comparten la misma composición de la membrana celular^16. Por lo tanto, los exosomas son una técnica prometedora de nueva generación para la reprogramación, pero su potencial para reprogramar células somáticas por su contenido todavía está bajo investigación. Los métodos basados en vectores virales utilizan virus modificados para transmitir genes de reprogramación a las células receptoras. Esta técnica, a pesar de la alta eficiencia de la reprogramación, no se considera segura, ya que la integración del virus dentro de la célula puede ser responsable de la infección, los teratomas y la inestabilidad genómica^17.

El siguiente protocolo para generar colonias de iPSC combina el cóctel de reprogramación de Yamanaka’s y Thompson y se basa en el uso de un método que requiere NM-RNAs y factores de evasión inmune con la posibilidad de realizarlo en condiciones libres de xeno. La razón de ser de este método es difundir, dentro de la comunidad científica, un protocolo que permita una reprogramación rápida, sencilla y altamente eficaz de los fibroblastos humanos adultos de la piel abdominal en iPSCs^18.

Los puntos fuertes del método propuesto son, de hecho, la facilidad de rendimiento y el poco tiempo necesario para obtener iPSC. Además, el método evita los mecanismos de defensa celular y el uso de vectores virales, responsables de cuestiones relevantes.

Con respecto al protocolo estándar, se realizaron las siguientes modificaciones: (1) Los fibroblastos confluentes se sincronizaron en el pasaje 4 al colocarse en un 0,1% de suero durante 48 h antes de la trippsinización; (2) La densidad celular para el cultivo y el volumen de reactivos se ajustaron para la utilización en una placa multi-pozo de 24 pocillos en lugar de una placa de 6 pocillos; (3) El experimento de reprogramación se realizó utilizando una incubadora de CO₂ al 5% en lugar de una incubadora con condiciones atmosféricas (21% O₂₎o hipoxicas (5% O₂).

Protocol

Los especímenes de tejido humano fueron recogidos de acuerdo con la Declaración de Helsinki mientras observaba las directrices del Hospital Universitario Federico II. Todos los pacientes involucrados en este estudio proporcionaron consentimiento por escrito. 1. Preparación de Suministros y Medios de Cultura Limpiar y autoclave un par grande de tijeras quirúrgicas, dos conjuntos de fórceps finos, dos pares de tijeras microdissezantes, botella estéril de 1 L, botella estéril de …

Representative Results

El objetivo del protocolo era reprogramar fibroblastos dérmicos aislados de la piel abdominal utilizando un método de reprogramación no integrador basado en NM-ARN para inducir la expresión de factores específicos. Para lograr este objetivo, los fibroblastos dérmicos humanos se aislaron de muestras de piel de pacientes sometidos a cirugía de abdominoplastia y se generaron isPC introduciendo oct4, Sox2, Klf4, cMyc, Nanog, factores de reprogramación Lin28 y factores de evasión inmune E3, K3, B18 mediante un kit de…

Discussion

los iPSC están emergiendo rápidamente como el candidato celular más prometedor para aplicaciones de medicina regenerativa y como una herramienta tremendamente útil para el modelado de enfermedades y pruebas de drogas^3,8. El protocolo presentado aquí describe la generación de iPSCs humanos a partir de una muestra que tiene el tamaño de una biopsia de punzonado de la piel con un procedimiento simple y eficiente que no requiere ningún equipo específico o ex…

Materials

10 mL serological pipet	Falcon	357551	Sterile, polystyrene
100 mm plates	Falcon	351029	Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubes	Falcon	352097	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
24-well plates	Falcon	353935	Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile
25 mL serological pipet	Falcon	357525	Sterile, polystyrene
35 mm plates	Falcon	353001	Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipet	Falcon	357543	Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubes	Falcon	352098	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Gibco	12491-015	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Sigma- Aldrich	D6429-500ml	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine Serum	Sigma- Aldrich	F9665-500ml	Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma- Aldrich	H1387-1L	Powder
L-glutamine	Lonza	BE17-605E	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	INVITROGEN	13778-030	Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 °C
Matrigel	CORNING	354234	Basement Membrane Matrix, store at -20 °C. Avoid multiple freeze-thaws.
Neubauer Chamber	VWR	631-1116	Hemocytometer
NutriStem XF Culture Medium	Biological Industries	05-100-1A-500ml	Xeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 °C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 °C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles.
Opti-MEM	Gibco	31985-062-100ml	Reduced-Serum Medium; store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Penicillin and Streptomycin	Sigma- Aldrich	P4333-100ml	Store at -20 °C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Potassium Chloride	Sigma- Aldrich	P9333	Powder
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma- Aldrich	P5665	Powder
RNase-free 0.5 mL tubes	Eppendorf	H0030124537	RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNase-free 1.5 mL tubes	Eppendorf	H0030120086	RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNaseZAP	INVITROGEN	AM9780	Cleaning agent for removing RNase
Sodium Bicarbonate	Sigma- Aldrich	S5761	Powder
Sodium Chloride	Sigma- Aldrich	S7653	Powder
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma- Aldrich	94046	Powder
StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit	Reprocell	00-0076	Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 °C.
Trypsin-EDTA	Sigma- Aldrich	T4049-100ml	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles