Isolierung von adulten menschlichen Dermal-Fibroblasten aus der Bauchhaut und Generierung induzierter pluripotenter Stammzellen mit einer nicht-integrierenden Methode

Summary

Die Zellumprogrammierung erfordert die Einführung von Schlüsselgenen, die den pluripotenten Zellzustand regulieren und aufrechterhalten. Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Bildung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen dermalen Fibroblasten ohne virale/integrierende Methoden, aber unter Verwendung nicht modifizierter RNAs (NM-RNAs) in Kombination mit Immunumgehungsfaktoren, die die zellulären Abwehrmechanismen reduzieren.

Abstract

Induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) konnten bisher als vielversprechende Quelle pluripotenter Zellen für die Behandlung von derzeit unheilbaren Krankheiten, für die Rekonstitution und Regeneration von verletztem Gewebe und für die Entwicklung neuer Medikamente betrachtet werden. Trotz aller Vorteile im Zusammenhang mit der Verwendung von iPSCs, wie das geringe Risiko einer Ablehnung, die verringerten ethischen Fragen und die Möglichkeit, sie von jungen und alten Patienten ohne Unterschied in ihrem Reprogrammierungspotenzial zu erhalten, Probleme zu überwinden sind immer noch zahlreich. Tatsächlich kann eine Zellumprogrammierung, die mit viralen und integrierenden Viren durchgeführt wird, Infektionen verursachen, und die Einführung der erforderlichen Gene kann eine genomische Instabilität der Empfängerzelle induzieren und deren Einsatz in der Klinik beeinträchtigen. Insbesondere gibt es viele Bedenken über die Verwendung des c-Myc-Gens, das aus mehreren Studien für seine mutationsinduzierende Aktivität bekannt ist. Fibroblasten haben sich als die geeignete Zellpopulation für die zelluläre Reprogrammierung herausgebildet, da sie leicht zu isolieren und zu kulturieren sind und durch eine minimalinvasive Hautpunschbiopsie geerntet werden. Das hier beschriebene Protokoll enthält eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Beschreibung des gesamten Verfahrens, von der Probenverarbeitung zur Gewinnung von Zellkulturen, der Wahl der Reagenzien und Vorräte, der Reinigung und Zubereitung bis hin zur Zellumprogrammierung mittels einer kommerziellen nicht modifizierte RNAs (NM-RNAs)-basiertes Reprogramming Kit. Das gewählte Reprogramming Kit ermöglicht eine effektive Umprogrammierung von humanem Dermalem Fibroblasten auf iPSCs und kleine Kolonien können bereits 24 h nach der ersten Transfektion gesehen werden, auch bei Modifikationen in Bezug auf das Standarddatenblatt. Das in diesem Protokoll verwendete Reprogrammierungsverfahren bietet den Vorteil einer sicheren Neuprogrammierung, ohne das Risiko von Infektionen, die durch virale vektorbasierte Methoden verursacht werden, reduziert die zellulären Abwehrmechanismen und ermöglicht die Generierung von xenofreien iPSCs, alle kritische Merkmale, die für weitere klinische Anwendungen obligatorisch sind.

Introduction

Die Zellumprogrammierung stellt eine neuartige Technologie dar, um jede somatische Zelle des Körpers in eine pluripotente Stammzelle, bekannt als iPSC^1,zu verwandeln. Die Möglichkeit, eine adulte somatische Zelle wieder in einen pluripotenten und undifferenzierten Zustand umzuprogrammieren, hat die Grenzen überwunden, die durch die schlechte Verfügbarkeit und ethische Fragen im Zusammenhang mit der Verwendung pluripotenter Zellen auferlegt wurden, die bisher nur von menschlichen Embryonen (embryonalen Stammzellen oder ESC)^abstammten2^,3,4. Im Jahr 2006 führten Kazutoshi Takahashi und Shinya Yamanaka eine bahnbrechende Studie durch, die die erste Umwandlung von adulten somatischen Zellen aus der Haut in pluripotente Zellen durch künstliche Zugabe von vier spezifischen Genen (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)⁵. Ein Jahr später führten arbeiten in Thomsons Labor zur erfolgreichen Umprogrammierung somatischer Zellen in iPSCs durch Transduktion einer anderen Kombination von vier Genen (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)⁶.

iPSCs bieten Wissenschaftlern und Forschern aus verschiedenen Bereichen, wie regenerative Medizin und Pharmakologie, eine Reihe von Möglichkeiten, um verschiedene Krankheiten zu untersuchen und zu behandeln, zusammen mit einer gechromischen Reflexion der Eigenschaften des Patienten, aus dem sie abgeleitet sind. Die Verwendung von iPSCs bietet mehrere Vorteile, darunter: das reduzierte Risiko für die Immunantwort aufgrund einer völlig autologen Herkunft der Zellen; die Möglichkeit, eine Zellbibliothek zu schaffen, ein wichtiges Werkzeug, um die Reaktion auf neue Medikamente und ihre Nebenwirkungen vorherzusagen, da sie in der Lage sind, sich kontinuierlich selbst zu erneuern und verschiedene Zelltypen zu erzeugen; und die Möglichkeit, einen maßgeschneiderten Ansatz für die Verabreichung von Arzneimitteln zu entwickeln^7,8,9.

Verschiedene Techniken sind derzeit bekannt, um die Expression der Reprogrammierungsfaktoren zu induzieren, und sie sind in zwei Hauptkategorien enthalten: nichtvirale und virale vektorbasierte Methoden^10,11,12,13. Nicht-virale Methoden umfassen mRNA-Transfektion, miRNA-Infektion/Transfektion, PiggyBac, Minicircle-Vektoren und episomale Plasmide und Exosomen^10,11,12,13. Virale Methoden umfassen nicht integrierende Viren wie Adenovirus, Sendai-Virus und Proteine sowie die Integration von Viren wie Retrovirus und Lentivirus^10,11,12,13.

Mehreren Studien zufolge wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen diesen Methoden in Bezug auf die Wirksamkeit der Zellreprogrammierung festgestellt, daher hängt die Wahl des geeigneten Verfahrens streng vom verwendeten Zelltyp und von den nachfolgenden Anwendungen der erhaltenen iPSCs^{ab 14,15}. Alle genannten Methoden zeigen Nachteile, zum Beispiel, das Sendai-Virus ist für alle Zelltypen wirksam, erfordert aber viele Passagen, um iPSCs zu erhalten; Die Umprogrammierung durch Episomen eignet sich hervorragend für Blutzellen, benötigt jedoch eine Änderung der Standardkulturbedingungen für Fibroblasten; die PiggyBac-Methode könnte eine attraktive Alternative darstellen, aber Studien in menschlichen Zellen sind immer noch begrenzt und schwach^10,11,12,13. Exosomen sind Nanovesikeln, die von Zellen physiologisch in alle Körperflüssigkeiten abgesondert werden. Jüngsten Studien zufolge sind sie für die interzelluläre Kommunikation verantwortlich und können in wichtigen biologischen Prozessen wie Zellproliferation, Migration und Differenzierung eine Rolle spielen. Exosomen können mRNA und miRNA mit einem völlig natürlichen Mechanismus transportieren und in Empfängerzellen übertragen, da sie die gleiche Zusammensetzung der Zellmembran¹⁶teilen. Daher sind Exosomen eine vielversprechende Neue-Generation-Technik für die Neuprogrammierung, aber ihr Potenzial, somatische Zellen nach ihrem Inhalt neu zu programmieren, wird noch untersucht. Virale vektorbasierte Methoden verwenden modifizierte Viren, um Reprogrammierungsgene an Empfängerzellen zu vermitteln. Diese Technik, trotz der hohen Effizienz der Umprogrammierung, gilt nicht als sicher, da die Integration des Virus in die Zelle für Infektionen, Teratome und genomische Instabilität verantwortlich sein kann¹⁷.

Das folgende Protokoll zur Erzeugung von iPSCs-Kolonien kombiniert den Neuprogrammierungscocktail von Yamanaka und Thompson und basiert auf der Anwendung einer Methode, die NM-RNAs und Immunevasion-Faktoren mit der Möglichkeit, sie unter xenofreien Bedingungen durchzuführen, erfordert. Der Grund für die Anwendung dieser Methode ist, innerhalb der wissenschaftlichen Gemeinschaft ein Protokoll zu verbreiten, das eine schnelle, einfache und hochwirksame Reprogrammierung von erwachsenen menschlichen Fibroblasten von der Bauchhaut in iPSCs¹⁸ermöglicht.

Die Stärken der vorgeschlagenen Methode sind in der Tat die einfache Leistung und die kurze Zeit, die für den Erhalt von iPSCs erforderlich ist. Darüber hinaus vermeidet die Methode zelluläre Abwehrmechanismen und die Verwendung von viralen Vektoren, die für relevante Probleme verantwortlich sind.

In Bezug auf das Standardprotokoll wurden folgende Änderungen vorgenommen: (1) Konfluente Fibroblasten wurden in Durchgang 4 synchronisiert, indem sie vor der Trypsinisierung 0,1% Serum für 48 h platzierten; (2) Die Zelldichte für Kultur und das Volumen der Reagenzien wurden für die Verwendung auf einer 24-Well-Multi-Well-Platte anstelle einer 6-Well-Platte angepasst; (3) Das Reprogrammierungsexperiment wurde mit einem 5%_{CO2-Inkubator} anstelle eines Inkubators mit atmosphärischen (21%_O2) oder hypoxischen (5%_O2) Bedingungen durchgeführt.

Protocol

Die Proben aus menschlichem Gewebe wurden gemäß der Erklärung von Helsinki unter Beachtung der Richtlinien des Universitätskrankenhauses Federico II gesammelt. Alle an dieser Studie beteiligten Patienten erteilten ihre schriftliche Zustimmung. 1. Vorbereitung von Lieferungen und Kulturmedien Reinigen und autoklavieren Sie ein großes Paar chirurgische Schere, zwei Sätze feine Zangen, zwei Paar mikrosezierende Schere, 1 L sterile Flasche, 500 ml sterile Flasche und eine 250 ml st…

Representative Results

Das Ziel des Protokolls war es, dermale Fibroblasten, die von der Bauchhaut isoliert wurden, mithilfe einer nicht-integrierenden Reprogrammierungsmethode auf Derm-RNAs neu zu programmieren, um die Expression spezifischer Faktoren zu induzieren. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden menschliche dermale Fibroblasten aus Hautproben von Patienten isoliert, die sich einer Bauchoperation unterziehen, und iPSCs wurden mit Democ4, Sox2, Klf4, cMyc, Nanog, Lin28 Reprogramming Factors und E3, K3, B18 Immunevasion-Faktoren durch ein …

Discussion

iPSCs entwickeln sich schnell zum vielversprechendsten Zellkandidaten für Anwendungen in der regenerativen Medizin und zu einem enorm nützlichen Werkzeug für die Krankheitsmodellierung und Arzneimitteltests^3,8. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt die Generierung menschlicher iPSCs aus einer Probe mit der Größe einer Hautpunschbiopsie mit einem einfachen und effizienten Verfahren, das keine spezifische Ausrüstung oder vorkenntnisse.

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Materials

10 mL serological pipet	Falcon	357551	Sterile, polystyrene
100 mm plates	Falcon	351029	Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubes	Falcon	352097	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
24-well plates	Falcon	353935	Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile
25 mL serological pipet	Falcon	357525	Sterile, polystyrene
35 mm plates	Falcon	353001	Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipet	Falcon	357543	Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubes	Falcon	352098	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Gibco	12491-015	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Sigma- Aldrich	D6429-500ml	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine Serum	Sigma- Aldrich	F9665-500ml	Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma- Aldrich	H1387-1L	Powder
L-glutamine	Lonza	BE17-605E	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	INVITROGEN	13778-030	Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 °C
Matrigel	CORNING	354234	Basement Membrane Matrix, store at -20 °C. Avoid multiple freeze-thaws.
Neubauer Chamber	VWR	631-1116	Hemocytometer
NutriStem XF Culture Medium	Biological Industries	05-100-1A-500ml	Xeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 °C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 °C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles.
Opti-MEM	Gibco	31985-062-100ml	Reduced-Serum Medium; store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Penicillin and Streptomycin	Sigma- Aldrich	P4333-100ml	Store at -20 °C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Potassium Chloride	Sigma- Aldrich	P9333	Powder
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma- Aldrich	P5665	Powder
RNase-free 0.5 mL tubes	Eppendorf	H0030124537	RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNase-free 1.5 mL tubes	Eppendorf	H0030120086	RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNaseZAP	INVITROGEN	AM9780	Cleaning agent for removing RNase
Sodium Bicarbonate	Sigma- Aldrich	S5761	Powder
Sodium Chloride	Sigma- Aldrich	S7653	Powder
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma- Aldrich	94046	Powder
StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit	Reprocell	00-0076	Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 °C.
Trypsin-EDTA	Sigma- Aldrich	T4049-100ml	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles