Изоляция взрослых человека дермальных фибробластов от кожи брюшной полости и поколение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с использованием неинтегрирующего метода

Summary

Перепрограммирование клеток требует введения ключевых генов, которые регулируют и поддерживают плюрипотентное клеточное состояние. Описанный протокол позволяет формировать индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) колонии из человеческих кожных фибробластов без вирусных/интеграционных методов, но с использованием немодифицированных РНК (NM-RNA) в сочетании с факторами иммунного уклонения, уменьшающими механизмы клеточной защиты.

Abstract

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (IПС) можно считать на сегодняшний день перспективным источником плюрипотентных клеток для лечения неизлечимых в настоящее время заболеваний, для восстановления и регенерации поврежденных тканей и для разработки новых препаратов. Несмотря на все преимущества, связанные с использованием iPSCs, такие как низкий риск отторжения, снижение этических вопросов, а также возможность получить их от молодых и старых пациентов без каких-либо различий в их перепрограммировании потенциал, проблемы для преодоления по-прежнему многочисленны. В самом деле, перепрограммирование клеток проводится с вирусными и интеграции вирусов может вызвать инфекции и введение необходимых генов может вызвать геномную нестабильность клетки-реципиента, ухудшая их использование в клинике. В частности, существует много опасений по поводу использования гена c-Myc, известного по нескольким исследованиям, для его мутационной активности. Фибробласты стали подходящей популяцией клеток для клеточного перепрограммирования, поскольку они легко изолируются и культуре и собирают сявречноинбиоцией пунша кожи. Описанный здесь протокол содержит подробное пошаговое описание всей процедуры, от обработки образцов до получения клеточных культур, выбора реагентов и принадлежностей, очистки и подготовки, перепрограммирования клеток с помощью коммерческого немодифицированные РНК (NM-RNA) на основе перепрограммирования комплекта. Выбранный набор перепрограммирования позволяет эффективно перепрограммировать человека дермальной фибробластов для iPSCs и небольших колоний можно увидеть уже в 24 ч после первого трансфекции, даже с изменениями в отношении стандартного листа данных. Процедура перепрограммирования, используемая в этом протоколе, предлагает преимущество безопасного перепрограммирования, без риска инфекций, вызванных вирусными векторными методами, уменьшает механизмы клеточной защиты, и позволяет генерации ксено-свободных iPSCs, все критические особенности, которые являются обязательными для дальнейшего клинического применения.

Introduction

Перепрограммирование клеток представляет собой новую технологию для преобразования каждой соматической клетки тела в плюрипотентную стволовую клетку, известную как iPSC^1. Возможность перепрограммирования взрослых соматических клеток обратно в плюрипотентное и недифференцированное состояние преодолела пределы, налагаемые плохой доступностью и этические вопросы, связанные с использованием плюрипотентных клеток, ранее только вытекающих из человеческих эмбрионов (эмбриональные стволовые клетки или ESC)^2,3,4. В 2006 году Кадзутоси Такахаси и Синья Яманака провели новаторское исследование, в ходе чего было проведено первое преобразование взрослых соматических клеток из кожи в плюрипотентные клетки путем искусственного добавления четырех специфических генов (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)⁵. Год спустя, работа, проведенная в лаборатории Томсона, привела к успешному перепрограммированию соматических клеток в iPSCs путем трансдукции другой комбинации из четырех генов (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)⁶.

iPSCs предлагают ряд возможностей для ученых и исследователей в различных областях, таких как регенеративная медицина и фармакология, являясь отличной платформой для изучения и лечения различных заболеваний наряду с генотипическим отражением характеристик пациента, из которых они получены. Использование iPSCs обеспечивает ряд преимуществ, включая: снижение риска иммунного ответа из-за полностью аутологичных происхождения клеток; возможность создания клеточной библиотеки, важного инструмента для прогнозирования реакции на новые лекарства и их побочные эффекты, поскольку они способны непрерывно самостоятельно обновлять и генерировать различные типы клеток; и возможность разработать индивидуальный подход к лекарственным препаратам^7,8,9.

Различные методы известны в настоящее время, чтобы вызвать выражение факторов перепрограммирования, и они включены в две основные категории: невирусные и вирусные векторные методы^10,11,12,13. Невирусные методы включают трансфекцию мРНК, инфекцию/трансфекцию миРНК, PiggyBac, переносчики мини-круга и эпизомальные плазмиды и экзосомы^10,11,12,13. Вирусные методы включают неинтегрирующие вирусы, такие как аденовирус, вирус Сендай и белки, а также интеграцию вирусов, таких как ретровирус и лентивирус^10,11,12,13.

По данным нескольких исследований, никаких существенных различий среди этих методов с точки зрения эффективности перепрограммирования клеток не было замечено, следовательно, выбор подходящего метода строго зависит от используемого типа клеток и от последующих применений iPSCs, полученных^14,15. Все упомянутые методы показывают недостатки, например, вирус Сендай эффективен на всех типах клеток, но требует много проходов для получения iPSCs; перепрограммирование эписомами отлично подходит для клеток крови, но нуждается в изменении стандартных условий культуры фибробластов; метод PiggyBac может представлять собой привлекательную альтернативу, но исследования в клетках человека по-прежнему ограничены и^{слабые 10,11,12,13}. Экзосомы являются нано-пузырьками физиологически выделяется во все жидкости организма клетками. Согласно последним исследованиям, они отвечают за межклеточную коммуникацию и могут играть определенную роль в важных биологических процессах, таких как пролиферация клеток, миграция и дифференциация. Экзосомы могут транспортировать и передавать мРНК и миРНК в клетки-реципиенты с полностью естественным механизмом, так как они имеют один и тот же состав клеточной мембраны^16. Таким образом, экзосомы являются перспективным методом нового поколения для перепрограммирования, но их потенциал для перепрограммирования соматических клеток по их содержанию все еще находится под следствием. Вирусные векторные методы используют вирусы, модифицированные для передачи генов перепрограммирования клеткам-реципиентам. Этот метод, несмотря на высокую эффективность перепрограммирования, не считается безопасным, так как интеграция вируса в клетку может быть ответственна за инфекцию, тератомы и геномную нестабильность¹⁷.

Следующий протокол для генерации колоний iPSCs сочетает в себе коктейль перепрограммирования Яманаки и Томпсона и основан на использовании метода, требующего NM-РНК и факторов уклонения от иммунитета с возможностью выполнения его в условиях, свободных от ксено. Обоснование использования этого метода заключается в распространении в рамках научного сообщества протокола, позволяющего быстрое, простое и высокоэффективное перепрограммирование фибробластов взрослого человека из брюшной кожи в iPSCs^18.

Сильные стороны предлагаемого метода, по сути, простота работоспособности и короткое время, необходимое для получения iPSCs. Кроме того, метод позволяет избежать механизмов клеточной защиты и использования вирусных векторов, ответственных за соответствующие вопросы.

Что касается стандартного протокола, то были внесены следующие изменения: (1) Конфлюентные фибробласты были синхронизированы при прохождении 4, размещая в 0,1% сыворотке 48 ч до трипсиизации; (2) Плотность клеток для культуры и объем реагентов были скорректированы для использования на 24-хорошо многоколодцной пластины вместо 6-колой пластины; (3) Эксперимент перепрограммирования был выполнен с использованием 5% CO₂ инкубатор вместо инкубатора с атмосферными (21% O₂) или гипоксических (5% O₂) условия.

Protocol

Образцы из тканей человека были собраны в соответствии с Хельсинкской декларацией при соблюдении руководящих принципов Университетской больницы Федерико II. Все пациенты, участвующие в этом исследовании, дали письменное согласие. 1. Подготовка поставок и культуры СРЕДСТ?…

Representative Results

Целью протокола была перепрограммирование дермальных фибробластов, изолированных от брюшной кожи, с использованием неинтегрирующего метода перепрограммирования на основе НМ-РНК, чтобы вызвать выражение конкретных факторов. Для достижения этой цели, человеческие дермальные фибробл?…

Discussion

iPSCs быстро становятся наиболее перспективными кандидатами клеток для регенеративной медицины приложений и как чрезвычайно полезный инструмент для моделирования заболеваний и тестирования на наркотики^3,8. Протокол, представленный здесь, описывает гене?…

Materials

10 mL serological pipet	Falcon	357551	Sterile, polystyrene
100 mm plates	Falcon	351029	Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubes	Falcon	352097	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
24-well plates	Falcon	353935	Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile
25 mL serological pipet	Falcon	357525	Sterile, polystyrene
35 mm plates	Falcon	353001	Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipet	Falcon	357543	Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubes	Falcon	352098	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Gibco	12491-015	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Sigma- Aldrich	D6429-500ml	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine Serum	Sigma- Aldrich	F9665-500ml	Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma- Aldrich	H1387-1L	Powder
L-glutamine	Lonza	BE17-605E	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	INVITROGEN	13778-030	Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 °C
Matrigel	CORNING	354234	Basement Membrane Matrix, store at -20 °C. Avoid multiple freeze-thaws.
Neubauer Chamber	VWR	631-1116	Hemocytometer
NutriStem XF Culture Medium	Biological Industries	05-100-1A-500ml	Xeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 °C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 °C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles.
Opti-MEM	Gibco	31985-062-100ml	Reduced-Serum Medium; store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Penicillin and Streptomycin	Sigma- Aldrich	P4333-100ml	Store at -20 °C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Potassium Chloride	Sigma- Aldrich	P9333	Powder
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma- Aldrich	P5665	Powder
RNase-free 0.5 mL tubes	Eppendorf	H0030124537	RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNase-free 1.5 mL tubes	Eppendorf	H0030120086	RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNaseZAP	INVITROGEN	AM9780	Cleaning agent for removing RNase
Sodium Bicarbonate	Sigma- Aldrich	S5761	Powder
Sodium Chloride	Sigma- Aldrich	S7653	Powder
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma- Aldrich	94046	Powder
StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit	Reprocell	00-0076	Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 °C.
Trypsin-EDTA	Sigma- Aldrich	T4049-100ml	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles