पेट की त्वचा और प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल की पीढ़ी से वयस्क मानव डर्मल फाइब्रोब्लास्ट का अलगाव एक गैर एकीकृत विधि का उपयोग कर
Summary
सेल रीप्रोग्रामिंग के लिए प्रमुख जीन की शुरूआत की आवश्यकता होती है, जो pluripotent सेल राज्य को विनियमित और बनाए रखते हैं। वर्णित प्रोटोकॉल वायरल/एकीकृत तरीकों के बिना मानव डर्मल फाइब्रोब्लास्ट से प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएससी) कालोनियों के गठन में सक्षम बनाता है, लेकिन गैर संशोधित RNAs (एनएम-RNAs) का उपयोग कर प्रतिरक्षा चोरी सेलुलर रक्षा तंत्र को कम करने के कारकों के साथ संयुक्त ।
Abstract
प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएससी) पर विचार किया जा सकता है, आज तक, वर्तमान में अनुपचारित रोगों के प्रबंधन के लिए pluripotent कोशिकाओं का एक आशाजनक स्रोत, पुनर्गठन और घायल ऊतकों के उत्थान के लिए और नई दवाओं के विकास के लिए । आईपीएससी के उपयोग से संबंधित सभी फायदों के बावजूद, जैसे अस्वीकृति का कम जोखिम, कम नैतिक मुद्दे, और युवा और पुराने दोनों रोगियों से उनकी पुनर्प्रोग्रामिंग क्षमता में किसी भी अंतर के बिना उन्हें प्राप्त करने की संभावना, समस्याओं को दूर करने के लिए अभी भी कई हैं। वास्तव में, वायरल और एकीकृत वायरस के साथ आयोजित सेल रीप्रोग्रामिंग संक्रमण पैदा कर सकता है और आवश्यक जीन की शुरूआत प्राप्तकर्ता कोशिका की जीनोमिक अस्थिरता को प्रेरित कर सकती है, जो क्लिनिक में उनके उपयोग को ख़राब कर सकती है। विशेष रूप से, सी-Myc जीन के उपयोग के बारे में कई चिंताएं हैं, जो इसके उत्परिवर्तन-उत्प्रेरण गतिविधि के लिए कई अध्ययनों से अच्छी तरह से जाना जाता है। फाइब्रोब्लास्ट सेलुलर रीप्रोग्रामिंग के लिए उपयुक्त सेल आबादी के रूप में उभरे हैं क्योंकि वे अलग-थलग और संस्कृति के लिए आसान हैं और न्यूनतम आक्रामक त्वचा पंच बायोप्सी द्वारा काटा जाता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल पूरी प्रक्रिया का एक विस्तृत कदम-दर-कदम विवरण प्रदान करता है, नमूना प्रसंस्करण से सेल संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए, अभिकर्मकों और आपूर्ति, सफाई और तैयारी का विकल्प, वाणिज्यिक के माध्यम से सेल रीप्रोग्रामिंग के लिए गैर-संशोधित आरएनए (एनएम-आरएनए) -आधारित रीप्रोग्रामिंग किट। चुना रीप्रोग्रामिंग किट आईपीएससी और छोटी कालोनियों के लिए मानव डर्मल फाइब्रोब्लास्ट के एक प्रभावी पुनर्प्रोग्रामिंग की अनुमति देता है पहले ट्रांसफेक्शन के बाद 24 घंटे के रूप में जल्दी देखा जा सकता है, यहां तक कि मानक डेटाशीट के संबंध में संशोधनों के साथ । इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली पुनर्प्रोग्रामिंग प्रक्रिया वायरल वेक्टर-आधारित तरीकों के कारण संक्रमण के जोखिम के बिना एक सुरक्षित पुनर्प्रोग्रामिंग का लाभ प्रदान करती है, सेलुलर रक्षा तंत्र को कम करती है, और ज़ेनो-मुक्त आईपीएससी की पीढ़ी की अनुमति देती है, सभी महत्वपूर्ण विशेषताएं जो आगे नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए अनिवार्य हैं।
Introduction
सेल रीप्रोग्रामिंग शरीर की हर दैहिक कोशिका को एक प्लीरिटेंट स्टेम सेल में बदलने के लिए एक उपन्यास तकनीक का प्रतिनिधित्व करता है, जिसे आईपीएससी1के नाम से जाना जाता है। एक वयस्क दैहिक कोशिका को एक प्लीरिशक्तिशाली और अविभेदित राज्य में वापस लाने की संभावना ने प्लीरिटेंट कोशिकाओं के उपयोग से संबंधित खराब उपलब्धता और नैतिक मुद्दों द्वारा लगाए गए सीमाओं को दूर कर दिया है, जो पहले केवल मानव भ्रूण (भ्रूणस्टेम कोशिकाओं या ईएससी)2,3,4से व्युत्पन्न है। 2006 में, काज़ुतोशी ताकाहाशी और शिन्या यामानाका ने कृत्रिम रूप से चार विशिष्ट जीन (अक्टूबर 4, सॉक्स2, Klf4, सी-Myc)5जोड़कर त्वचा से वयस्क दैहिक कोशिकाओं को प्लुरिपोटेबल कोशिकाओं में प्राप्त करने के लिए एक अग्रणी अध्ययन किया। एक साल बाद, थॉमसन की प्रयोगशाला में किए गए काम ने चार जीन (अक्टूबर 4, Sox2, नैनोग, Lin28)6के एक अलग संयोजन के ट्रांसड्यूक्शन द्वारा आईपीएससी में दैहिक कोशिकाओं की सफल पुनर्प्रोग्रामिंग का नेतृत्व किया ।
आईपीएससी विभिन्न क्षेत्रों के वैज्ञानिकों और शोधकर्ताओं को कई अवसर प्रदान करते हैं, जैसे पुनर्योजी चिकित्सा और फार्माकोलॉजी, रोगी की विशेषताओं का एक जीनोटिपिक प्रतिबिंब के साथ विभिन्न रोगों का अध्ययन और इलाज करने के लिए एक उत्कृष्ट मंच है। आईपीएससी का उपयोग कई फायदे प्रदान करता है जिसमें शामिल हैं: कोशिकाओं की पूरी तरह से ऑटोलॉगस मूल के कारण प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए कम जोखिम; एक सेल लाइब्रेरी बनाने की संभावना, नई दवाओं और उनके दुष्प्रभावों के जवाब की भविष्यवाणी करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण, क्योंकि वे लगातार आत्म-नवीनीकृत और विभिन्न सेल प्रकार उत्पन्न करने में सक्षम हैं; और दवा प्रशासन7,8,9के लिए एक अनुकूलित दृष्टिकोण विकसित करने का मौका .
वर्तमान में विविध तकनीकों को पुनर्प्रोग्रामिंग कारकों की अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए जाना जाता है और उन्हें दो प्रमुख श्रेणियों में शामिल किया गया है: गैर-वायरल और वायरल वेक्टर आधारित विधियां10,11,12,13। गैर-वायरल तरीकों में एमआरएनए ट्रांसफेक्शन, मिरना संक्रमण/ट्रांसफेक्शन, पिग्गीबेक, मिनीसर्कल वैक्टर और एपिसोमल प्लाज्मिड्स और एक्सोसोम्स10,11,12,13शामिल हैं । वायरल आधारित तरीकों में एडेनोवायरस, सेंडाइ वायरस और प्रोटीन जैसे गैर-एकीकृत वायरस शामिल हैं, और रेट्रोवायरस और लेंटिवायरस10,11,12,13जैसे वायरस को एकीकृत करना शामिल है ।
कई अध्ययनों के अनुसार, सेल रीप्रोग्रामिंग की प्रभावशीलता के संदर्भ में इन तरीकों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया है, इसलिए, उपयुक्त विधि का चुनाव सख्ती से उपयोग किए गए सेल प्रकार और आईपीएससी के बाद के अनुप्रयोगों पर निर्भर करता है14,15प्राप्त किया। सभी उल्लिखित विधियां नुकसान दिखाती हैं, उदाहरण के लिए, सेंडाइ वायरस सभी सेल प्रकारों पर प्रभावी है, लेकिन आईपीएससी प्राप्त करने के लिए बहुत सारे मार्ग की आवश्यकता होती है; एपिसोम्स द्वारा पुनर्प्रोग्रामिंग रक्त कोशिकाओं के लिए उत्कृष्ट है, लेकिन फाइब्रोब्लास्ट के लिए मानक संस्कृति की स्थिति में संशोधन की आवश्यकता है; पिग्गीबेक विधि एक आकर्षक विकल्प का प्रतिनिधित्व कर सकती है लेकिन मानव कोशिकाओं में अध्ययन अभी भी सीमित और कमजोर 10,11,12,13 हैं। एक्सोसोम्स नैनो-वेसिकल्स फिजिकली कोशिकाओं द्वारा सभी शरीर के तरल पदार्थों में स्रावित होते हैं। हाल के अध्ययनों के अनुसार, वे अंतरकोशिकीय संचार के लिए जिम्मेदार हैं और कोशिका प्रसार, प्रवास और भेदभाव जैसी महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाओं में भूमिका निभा सकते हैं। एक्सोसोम्स पूरी तरह से प्राकृतिक तंत्र के साथ प्राप्तकर्ता कोशिकाओं को एमआरएनए और मिरना का परिवहन और हस्तांतरण कर सकते हैं, क्योंकि वे कोशिका झिल्ली16की एक ही संरचना साझा करते हैं। इसलिए, एक्सोसोमरीप्रोग्रामिंग के लिए एक आशाजनक नई पीढ़ी की तकनीक है, लेकिन उनकी सामग्री द्वारा दैहिक कोशिकाओं को फिर से प्रोग्राम करने की उनकी क्षमता अभी भी जांच के घेरे में है। वायरल वेक्टर आधारित तरीके प्राप्तकर्ता कोशिकाओं को रीप्रोग्रामिंग जीन व्यक्त करने के लिए संशोधित वायरस का उपयोग करते हैं। पुनर्प्रोग्रामिंग की उच्च दक्षता के बावजूद इस तकनीक को सुरक्षित नहीं माना जाता है, क्योंकि कोशिका के भीतर वायरस का एकीकरण संक्रमण, टेराटोमा और जीनोमिक अस्थिरता17के लिए जिम्मेदार हो सकता है।
आईपीएससी कालोनियों को उत्पन्न करने के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल यामानाका और थॉमसन के पुनर्प्रोग्रामिंग कॉकटेल को जोड़ती है और एक विधि के उपयोग पर आधारित है जिसमें एनएम-आरएनए और प्रतिरक्षा चोरी कारकों की आवश्यकता होती है, जो इसे ज़ेनो-मुक्त स्थितियों में प्रदर्शन करने की संभावना के साथ होती है। इस विधि के उपयोग के पीछे तर्क वैज्ञानिक समुदाय के भीतर फैलना है, एक प्रोटोकॉल जो पेट की त्वचा से आईपीएससी18में वयस्क मानव फाइब्रोब्लास्ट की तेजी से, सरल और अत्यधिक प्रभावी पुनर्प्रोग्रामिंग की अनुमति देता है।
प्रस्तावित विधि की ताकत वास्तव में, प्रदर्शन में आसानी और आईपीएससी प्राप्त करने के लिए आवश्यक कम समय है । इसके अलावा, विधि सेलुलर रक्षा तंत्र और वायरल वेक्टर, प्रासंगिक मुद्दों के लिए जिम्मेदार के उपयोग से बचा जाता है ।
मानक प्रोटोकॉल के संबंध में, निम्नलिखित संशोधन किए गए थे: (1) समप्रवाह फाइब्रोब्लास्ट को ट्रिपसिनाइजेशन से पहले 48 घंटे के लिए 0.1% सीरम में रखकर 4 मार्ग पर सिंक्रोनाइज्ड किया गया था; (2) संस्कृति के लिए सेलुलर घनत्व और अभिकर्मकों की मात्रा को 6-अच्छी प्लेट के बजाय 24-अच्छी तरह से बहु-अच्छी प्लेट पर उपयोग के लिए समायोजित किया गया था; (3) वायुमंडलीय (21% ओ2)या हाइपोक्सिक (5% ओ2)स्थितियों के साथ इनक्यूबेटर के बजाय 5% सीओ2 इनक्यूबेटर का उपयोग करके रीप्रोग्रामिंग प्रयोग किया गया था।
Protocol
Representative Results
Discussion
आईपीएससी पुनर्योजी चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए सबसे होनहार सेल उम्मीदवार के रूप में तेजी से उभर रहे हैं और रोग मॉडलिंग और दवा परीक्षण3,8के लिए एक काफी उपयोगी उपकरण के रूप में । यह?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों को कोई पावती नहीं है ।
Materials
| 10 mL serological pipet | Falcon | 357551 | Sterile, polystyrene |
| 100 mm plates | Falcon | 351029 | Treated, sterile cell culture dish |
| 15 mL sterile tubes | Falcon | 352097 | Centrifuge sterile tubes, polypropylene |
| 24-well plates | Falcon | 353935 | Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile |
| 25 mL serological pipet | Falcon | 357525 | Sterile, polystyrene |
| 35 mm plates | Falcon | 353001 | Treated, sterile cell culture dish |
| 5 mL serological pipet | Falcon | 357543 | Sterile, polystyrene |
| 50 mL sterile tubes | Falcon | 352098 | Centrifuge sterile tubes, polypropylene |
| Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 12491-015 | Store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Sigma- Aldrich | D6429-500ml | Store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
| Fetal Bovine Serum | Sigma- Aldrich | F9665-500ml | Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma- Aldrich | H1387-1L | Powder |
| L-glutamine | Lonza | BE17-605E | Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | INVITROGEN | 13778-030 | Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 °C |
| Matrigel | CORNING | 354234 | Basement Membrane Matrix, store at -20 °C. Avoid multiple freeze-thaws. |
| Neubauer Chamber | VWR | 631-1116 | Hemocytometer |
| NutriStem XF Culture Medium | Biological Industries | 05-100-1A-500ml | Xeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 °C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 °C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-062-100ml | Reduced-Serum Medium; store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma- Aldrich | P4333-100ml | Store at -20 °C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
| Potassium Chloride | Sigma- Aldrich | P9333 | Powder |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma- Aldrich | P5665 | Powder |
| RNase-free 0.5 mL tubes | Eppendorf | H0030124537 | RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Eppendorf | H0030120086 | RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene |
| RNaseZAP | INVITROGEN | AM9780 | Cleaning agent for removing RNase |
| Sodium Bicarbonate | Sigma- Aldrich | S5761 | Powder |
| Sodium Chloride | Sigma- Aldrich | S7653 | Powder |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma- Aldrich | 94046 | Powder |
| StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit | Reprocell | 00-0076 | Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 °C. |
| Trypsin-EDTA | Sigma- Aldrich | T4049-100ml | Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
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