نموذج تلقيح لوحة الماوس للقدم لدراسة الاستجابات العصبية المستحثة بالفيروسات
Summary
نموذج تلقيح القدمين هو أداة قيمة لتميز الاستجابات العصبية الفيروسية في الجسم الحي. على وجه الخصوص، فإنه يوفر تقييما واضحا للحركيات الفيروسية والعمليات المناعية المرتبطة بها التي بدأت في الجهاز العصبي المحيطي.
Abstract
يصف هذا البروتوكول نموذج تلقيح الاقدام المستخدم لدراسة بدء وتطوير الاستجابات العصبية خلال عدوى فيروس الفاتس في الفئران. كما alphaherpesviruses هي الغزاة الرئيسيين للجهاز العصبي المحيطي (PNS)، وهذا النموذج هو مناسبة لتوصيف الحركية من تكرار الفيروسية، وانتشاره من PNS إلى CNS، والاستجابات العصبية المرتبطة. يسمح نموذج التطعيم في لوحة القدم لجزيئات الفيروسات بلانتشار من موقع العدوى الأساسي في البشرة في منصة القدم إلى الألياف العصبية الحسية والمتعاطفة التي تُعمّق البشرة والغدد العرقية والأدمة. تنتشر العدوى عبر العصب الوركي إلى جذر الظهر (DRG) وفي نهاية المطاف من خلال الحبل الشوكي إلى الدماغ. هنا ، يتم تلقيح لوحة قدم الماوس مع فيروس pseudorabies (PRV) ، وهو فيروس ألفابروكس وثيق الصلة بفيروس الهربس البسيط (HSV) وفيروس varicella-zoster (VZV). هذا النموذج يدل على أن عدوى PRV يؤدي إلى التهاب حاد, تتميز بتسلل العدلات في مهبط القدم وDG. يتم الكشف عن تركيزات عالية من السيتوكينات الالتهابية في وقت لاحق في الأنسجة المتجانسة بواسطة ELISA. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ وجود ارتباط قوي بين جين PRV والتعبير البروتيني (عبر qPCR و IF تلطيخ) في DRG وإنتاج السيتوكينات الموالية للالتهابات. لذلك، يوفر نموذج التلقيح في الاقدام فهما أفضل للعمليات الكامنة تحت alphaherpes التي يسببها فيروس اعتلال الأعصاب، وقد يؤدي إلى تطوير استراتيجيات علاجية مبتكرة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للنموذج توجيه البحوث على الاعتلالات العصبية الطرفية، مثل التصلب المتعدد والأضرار الناجمة عن الفيروسية المرتبطة بها إلى PNS. وفي نهاية المطاف، يمكن أن تكون أداة فعالة من حيث التكلفة في مجال تطوير العقاقير.
Introduction
تصف هذه الدراسة نموذج تلقيح الاقدام للتحقيق في تكرار وانتشار الفيروسات من PNS إلى CNS والاستجابات العصبية المرتبطة بها. وقد استخدم نموذج التطعيم في الاقدام بشكل مكثف لدراسة عدوى فيروس ألفا هيب في الخلايا العصبية1,2,3. والهدف الرئيسي لهذا النموذج هو السماح للفيروسات العصبية قطع مسافة قصوى من خلال الـ PNS قبل الوصول إلى الجهاز العصبي المركزي. هنا، يستخدم هذا النموذج للحصول على رؤى جديدة في تطوير اعتلال عصبي معين (حكة عصبية) في الفئران المصابة بفيروسات الإيدز (PRV).
PRV هو فيروس ألفاهرب مرتبط بالعديد من مسببات الأمراض المعروفة (أي الهربس البسيط النوع 1 و 2 [HSV1 و HSV2] وفيروسات الزوجة فاريتشيلا [VZV])، التي تسبب القروح الباردة، والآفات التناسلية، وجدري الماء، على التوالي4. هذه الفيروسات هي جميع pantropic وقادرة على إصابة العديد من أنواع الخلايا المختلفة دون إظهار تقارب لنوع أنسجة محددة. ومع ذلك ، فإنها تظهر جميعها عصبية مميزة من خلال غزو PNS (وأحيانا ، CNS) من الأنواع المضيفة. المضيف الطبيعي هو الخنزير ، ولكن PRV يمكن أن تصيب معظم الثدييات. في هذه المضيفين غير الطبيعية، PRV يصيب PNS ويحفز pruritus حاد يسمى “جنون حكة”، تليها الموت peracute5،6. دور استجابة المناعة العصبية في النتيجة السريرية والأمراض من العدوى PRV كان غير مفهومة بشكل جيد.
يسمح نموذج التطعيم في لوحة القدم لـ PRV ببدء العدوى في خلايا البشرة في لوحة القدم. ثم، تنتشر العدوى في الألياف العصبية الحسية والمتعاطفة التي تعم البشرة والغدد العرقية والأدمة. العدوى ينتشر عن طريق جزيئات الفيروس تتحرك عبر العصب الوركي إلى DRG في غضون 60 ساعة تقريبا. تنتشر العدوى عبر الحبل الشوكي، وتصل في نهاية المطاف إلى الـ hindbrain عندما تصبح الحيوانات محتضرة (82 ساعة بعد العدوى). خلال هذه النافذة الزمنية، يمكن جمع عينات الأنسجة ومعالجتها وتحليلها من أجل تكرار الفيروسات وعلامات الاستجابة المناعية. على سبيل المثال، يمكن إجراء الفحص النسيجي وتكميم الحمل الفيروسي في أنسجة مختلفة لإنشاء ارتباط بين بدء وتطوير العمليات السريرية والفيروسية والعصبية في التسبب في الـ PRV.
باستخدام نموذج تلقيح لوحة القدمين ، يمكن التحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية من pruritus الناجم عن PRV في الفئران. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يوفر هذا النموذج نظرة جديدة في بدء وتطوير العصبية الناجمة عن الفيروسات خلال التهابات فيروس الهربس. قد يؤدي فهم أفضل للعمليات الكامنة الكامنة في اضطرابات الأعصاب الناجمة عن فيروس ألفا هيريس إلى تطوير استراتيجيات علاجية مبتكرة. على سبيل المثال، هذا النموذج مفيد للتحقيق في آليات حكة الأعصاب في المرضى الذين يعانون من آفات ما بعد الهربس (على سبيل المثال، الهربس، القوباء المنطقية) واختبار الأهداف العلاجية الجديدة في الفئران للأمراض البشرية المقابلة.
Protocol
Representative Results
Discussion
نموذج تطعيم القدم الموصوف هنا مفيد للتحقيق في بدء وتطوير استجابات الوهن العصبي أثناء عدوى فيروس ألفاهرب. وعلاوة على ذلك، يستخدم هذا في نموذج الجسم الحي لتحديد الحركية من النسخ المتماثل وانتشار فيروس ألفاهرب من PNS إلى CNS. هذا هو بديل لنماذج التلقيح الأخرى، مثل نموذج تلقيح الجلد الجناح، الذ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب الاعتراف تشارلز ريفر مختبرات لدعمها التقني الممتاز تنفيذ التحليلات الهستوبات. تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NINDS) (RO1 NS033506 و RO1 NS060699). ولم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة، وجمع البيانات وتحليلها، أو في اتخاذ قرار بنشرها، أو إعدادها.
Materials
| Antibody anti-PRV gB | Made by the lab | 1/500 dilution | |
| Aqua-hold2 pap pen red | Fisher scientific | 2886909 | |
| Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files) | Revlon | ||
| Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| C57BL/6 mice (5-7 weeks) | The Jackson Laboratories | ||
| DAPI solution (1mg/ml) | Fisher scientific | 62248 | 1/1000 dilution |
| Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm | Sigma-Aldrich | P5731500 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30022 | |
| Dulbecco's Phophate Buffer Saline (PBS) solution | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30088 | |
| Fine curved scissors stainless steel | FST | 14095-11 | |
| Fluoromount-G mounting media | Fisher scientific | 0100-01 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Microcentrifuge tube 2ml | Denville Scientific | 1000945 | |
| Microtube 1.5ml | SARSTEDT | 72692005 | |
| Negative goat serum | Vector | S-1000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 154022 | |
| Precision Glide needle 18G | BD | 305196 | |
| Razor blades steel back | Personna | 9412071 | |
| RNA lysis buffer (RLT) | Qiagen | 79216 | |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
| Superfrost/plus microscopic slides | Fisher scientific | 12-550-15 | |
| Tissue lyser LT | Qiagen | 69980 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 | |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | 1/2000 dilution |
Riferimenti
- Field, H. J., Hill, T. J. The pathogenesis of pseudorabies in mice following peripheral inoculation. Journal of General Virology. 23 (2), 145-157 (1974).
- Engel, J. P., Madigan, T. C., Peterson, G. M. The transneuronal spread phenotype of herpes simplex virus type 1 infection of the mouse hind footpad. Journal of Virology. 71 (3), 2425-2435 (1997).
- Guedon, J. M., et al. Neuronal changes induced by Varicella Zoster Virus in a rat model of postherpetic neuralgia. Virology. 482, 167-180 (2015).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
- Wittmann, G., Rziha, H. J., Knipe, D. M., Howley, P. M. Aujeszky’s disease (pseudorabies) in pigs. Herpesvirus diseases of cattle, horses and pigs. 9, 230-325 (1989).
- Leman, A. D., Glock, R. D., Mengeling, W. L., Penny, R. H. C., Scholl, E., Straw, B. . Diseases of swine, 6th ed. , 209-223 (1986).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, 82 (2016).
- Sands, S. A., Leung-Toung, R., Wang, Y., Connelly, J., LeVine, S. M. Enhanced Histochemical Detection of Iron in Paraffin Sections of Mouse Central Nervous System Tissue: Application in the APP/PS1 Mouse Model of Alzheimer’s Disease. ASN Neuro. 8 (5), (2016).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Koyuncu, O. O., MacGibeny, M. A., Hogue, I. B., Enquist, L. W. Compartmented neuronal cultures reveal two distinct mechanisms for alpha herpesvirus escape from genome silencing. PLoS pathogens. 13 (10), 1006608 (2017).
- Laval, K., Vernejoul, J. B., Van Cleemput, J., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Virulent Pseudorabies Virus Infection Induces a Specific and Lethal Systemic Inflammatory Response in Mice. Journal of Virology. 92 (24), 01614-01618 (2018).
- Laval, K., Van Cleemput, J., Vernejoul, J. B., Enquist, L. W. Alphaherpesvirus infection of mice primes PNS neurons to an inflammatory state regulated by TLR2 and type I IFN signaling. PLoS Pathogens. 15 (11), 1008087 (2019).
- Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
- Mancini, M., Vidal, S. M. Insights into the pathogenesis of herpes simplex encephalitis from mouse models. Mammalian Genome: Official Journal of the International Mammalian Genome Society. 29 (7-8), 425-445 (2018).
- Kopp, S. J., et al. Infection of neurons and encephalitis after intracranial inoculation of herpes simplex virus requires the entry receptor nectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17916-17920 (2009).
- Wang, J. P., et al. Role of specific innate immune responses in herpes simplex virus infection of the central nervous system. Journal of Virology. 86 (4), 2273-2281 (2012).
- Haberthur, K., Messaoudi, I. Animal models of varicella zoster virus infection. Pathogens. 2 (2), 364-382 (2013).
- Sarova-Pinhas, I., Achiron, A., Gilad, R., Lampl, Y. Peripheral neuropathy in multiple sclerosis: a clinical and electrophysiologic study. Acta Neurologica Scandinavia. 91 (4), 234-238 (1995).
- MacGibeny, M. A., Koyuncu, O. O., Wirblich, C., Schnell, M. J., Enquist, L. W. Retrograde axonal transport of rabies virus is unaffected by interferon treatment but blocked by emetine locally in axons. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007188 (2018).
- Hunsperger, E. A., Roehrig, J. T. Temporal analyses of the neuropathogenesis of a West Nile virus infection in mice. Journal of Neurovirology. 12 (2), 129-139 (2006).
- Swartwout, B. K., et al. Zika Virus Persistently and Productively Infects Primary Adult Sensory Neurons In Vitro. Pathogens. 6 (4), 49 (2017).
- Racaniello, V. R. One hundred years of poliovirus pathogenesis. Virology. 344 (1), 9-16 (2006).
