Modelo de inoculação do footpad do mouse para estudar respostas neuroinflamatórias induzidas pelo viral
Summary
O modelo de inoculação do footpad é uma ferramenta valiosa para caracterizar respostas neuroinflamatórias invulgadas pelo viral in vivo. Em particular, fornece uma avaliação clara da cinética viral e processos imunopatológicos associados iniciados no sistema nervoso periférico.
Abstract
Este protocolo descreve um modelo de inoculação de footpad usado para estudar a iniciação e o desenvolvimento de respostas neuroinflamatórias durante a infecção por alphaherpesvírus em camundongos. Como os alfaherpesvírus são os principais invasores do sistema nervoso periférico (PNS), este modelo é adequado para caracterizar a cinética da replicação viral, sua disseminação da PNS para o CNS e respostas neuroinflamatórias associadas. O modelo de inoculação do footpad permite que partículas de vírus se espalhem de um local de infecção primária no pênco epiderme para fibras nervosas sensoriais e simpáticas que inervam a epiderme, glândulas sudoríparas e derme. A infecção se espalha através do nervo ciático para a gânglio raiz dorsal (DRG) e, finalmente, através da medula espinhal para o cérebro. Aqui, um footpad de rato é inoculado com o vírus pseudorabies (PRV), um alphaherpesvirus intimamente relacionado ao vírus herpes simplex (HSV) e ao vírus varicela-zoster (VZV). Este modelo demonstra que a infecção por PRV induz inflamação grave, caracterizada pela infiltração de neutrófilos no footpad e DRG. Altas concentrações de citocinas inflamatórias são posteriormente detectadas em tecidos homogeneizados pela ELISA. Além disso, observa-se uma forte correlação entre a expressão genética prv e proteína (via qPCR e se coloração) em DRG e a produção de citocinas pró-inflamatórias. Portanto, o modelo de inoculação do footpad proporciona uma melhor compreensão dos processos subjacentes às neuropatias induzidas pelo alfaherpesvírus e pode levar ao desenvolvimento de estratégias terapêuticas inovadoras. Além disso, o modelo pode orientar pesquisas sobre neuropatias periféricas, como esclerose múltipla e danos induzidos por virais associados à PNS. Em última análise, pode servir como uma ferramenta in vivo econômica para o desenvolvimento de medicamentos.
Introduction
Este estudo descreve um modelo de inoculação de footpad para investigar a replicação e disseminação de vírus da PNS para o CNS e respostas neuroinflamatórias associadas. O modelo de inoculação do footpad tem sido intensamente utilizado para estudar a infecção por alfaherpesvírus nos neurônios1,,2,3. O principal objetivo deste modelo é permitir que os vírus neurotrópicos percorram uma distância máxima através da PNS antes de atingir o CNS. Aqui, este modelo é usado para obter novas percepções no desenvolvimento de uma neuropatia particular (coceira neuropática) em camundongos infectados com o vírus pseudorabies (PRV).
PRV é um alphaherpesvirus relacionado a vários patógenos conhecidos (ou seja, herpes simplex tipo 1 e 2 [HSV1 e HSV2] e vírus varicela-zoster [VZV]), que causam feridas frias, lesões genitais e catapora,respectivamente 4. Esses vírus são todos pantrópicos e capazes de infectar muitos tipos de células diferentes sem mostrar afinidade por um tipo específico de tecido. No entanto, todos eles exibem um neurotropismo característico invadindo a PNS (e ocasionalmente, o CNS) de espécies hospedeiras. O hospedeiro natural é o porco, mas o PRV pode infectar a maioria dos mamíferos. Nesses hospedeiros não naturais, o PRV infecta a PNS e induz um prurido grave chamado “coceira louca”, seguido de morte peraguada5,6. O papel da resposta neuroimune no desfecho clínico e na patogênese da infecção pelo PRV tem sido mal compreendido.
O modelo de inoculação do footpad permite que o PRV inicie a infecção nas células epidérmicas do footpad. Em seguida, a infecção se espalha em fibras nervosas sensoriais e simpáticas que inervam a epiderme, as glândulas sudoríparas e a derme. A infecção se espalha por partículas de vírus movendo-se através do nervo ciático para o DRG dentro de aproximadamente 60 h. A infecção se espalha pela medula espinhal, atingindo o cérebro traseiro quando os animais ficam moribundos (82 h pós-infecção). Durante esta janela de tempo, amostras de tecido podem ser coletadas, processadas e analisadas para replicação de vírus e marcadores da resposta imune. Por exemplo, o exame histológico e a quantificação da carga viral podem ser realizados em diferentes tecidos para estabelecer correlações entre o início e o desenvolvimento de processos clínicos, virológicos e neuroinflamatórios na patogênese prv.
Utilizando o modelo de inoculação do footpad, os mecanismos celulares e moleculares do prurido induzido pelo PRV em camundongos podem ser investigados. Além disso, este modelo pode fornecer uma nova visão sobre a iniciação e desenvolvimento da neuroinflamação induzida pelo vírus durante infecções por herpesvírus. Uma melhor compreensão dos processos subjacentes a neuropatias induzidas por alphaherpesvírus pode levar ao desenvolvimento de estratégias terapêuticas inovadoras. Por exemplo, este modelo é útil para investigar os mecanismos de coceira neuropática em pacientes com lesões pós-herpéticas (por exemplo, herpes zoster, telhas) e testar novos alvos terapêuticos em camundongos para as doenças humanas correspondentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
O modelo de inoculação do footpad descrito aqui é útil para investigar a iniciação e o desenvolvimento de respostas neuroinflamatórias durante a infecção por alfaherpesvírus. Além disso, este modelo in vivo é usado para estabelecer a cinética da replicação e disseminação do alphaherpesvirus da PNS para o CNS. Trata-se de um alternado para outros modelos de inoculação, como o modelo de inoculação da pele flanco, que conta com arranhões dérmicos profundos13, ou a rota intracra…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem os laboratórios de Charles River por seu excelente apoio técnico executando as análises histopatologias. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e AVC (NINDS) (RO1 NS033506 e RO1 NS060699). Os financiadores não tiveram papel na concepção do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou elaboração do manuscrito.
Materials
| Antibody anti-PRV gB | Made by the lab | 1/500 dilution | |
| Aqua-hold2 pap pen red | Fisher scientific | 2886909 | |
| Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files) | Revlon | ||
| Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| C57BL/6 mice (5-7 weeks) | The Jackson Laboratories | ||
| DAPI solution (1mg/ml) | Fisher scientific | 62248 | 1/1000 dilution |
| Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm | Sigma-Aldrich | P5731500 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30022 | |
| Dulbecco's Phophate Buffer Saline (PBS) solution | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30088 | |
| Fine curved scissors stainless steel | FST | 14095-11 | |
| Fluoromount-G mounting media | Fisher scientific | 0100-01 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Microcentrifuge tube 2ml | Denville Scientific | 1000945 | |
| Microtube 1.5ml | SARSTEDT | 72692005 | |
| Negative goat serum | Vector | S-1000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 154022 | |
| Precision Glide needle 18G | BD | 305196 | |
| Razor blades steel back | Personna | 9412071 | |
| RNA lysis buffer (RLT) | Qiagen | 79216 | |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
| Superfrost/plus microscopic slides | Fisher scientific | 12-550-15 | |
| Tissue lyser LT | Qiagen | 69980 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 | |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | 1/2000 dilution |
Riferimenti
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