Mouse Footpad Inenting Model om virale geïnduceerde neuro-ontstekingsreacties te bestuderen
Summary
Het voetpad inentingsmodel is een waardevol hulpmiddel voor het karakteriseren van virale geïnduceerde neuro-inducerende reacties in vivo. Het biedt met name een duidelijke beoordeling van virale kinetiek en bijbehorende immunopathologische processen die in het perifere zenuwstelsel worden geïnitieerd.
Abstract
Dit protocol beschrijft een voetpad inenting model dat wordt gebruikt om de initiatie en ontwikkeling van neuro-inflammatoire reacties tijdens alphaherpesvirus infectie bij muizen te bestuderen. Als alfaherpesvirussen zijn belangrijkste indringers van het perifere zenuwstelsel (PNS), dit model is geschikt om de kinetiek van virale replicatie, de verspreiding ervan van de PNS naar CNS, en de bijbehorende neuro-inflammatorische reacties te karakteriseren. Het voetpad inentingsmodel maakt het mogelijk virusdeeltjes te verspreiden van een primaire infectie site in het voetpad opperhuid tot zintuiglijke en sympathische zenuwvezels die innervate de opperhuid, zweetklieren, en dermis. De infectie verspreidt zich via de heupzenuw naar de rugwortel ganglia (DRG) en uiteindelijk via het ruggenmerg naar de hersenen. Hier wordt een muisvoetpad ingeënt met pseudorabiesvirus (PRV), een alfaherpesvirus dat nauw verwant is aan het Herpes simplex virus (HSV) en het varicella-zostervirus (VZV). Dit model toont aan dat PRV-infectie ernstige ontsteking veroorzaakt, gekenmerkt door neutrofiele infiltratie in het voetpad en DRG. Hoge concentraties inflammatoire cytokinen worden vervolgens gedetecteerd in gehomogeniseerde weefsels door ELISA. Daarnaast wordt een sterke correlatie waargenomen tussen PRV-gen- en eiwitexpressie (via qPCR en IF-kleuring) in DRG en de productie van pro-inflammatoire cytokinen. Daarom biedt het voetpad inentingsmodel een beter begrip van de processen die ten grondslag liggen aan alfaherpesvirus-geïnduceerde neuropathieën en kan het leiden tot de ontwikkeling van innovatieve therapeutische strategieën. Daarnaast kan het model onderzoek naar perifere neuropathieën begeleiden, zoals multiple sclerose en bijbehorende virale schade aan de PNS. Uiteindelijk kan het dienen als een kosteneffectief in vivo instrument voor de ontwikkeling van geneesmiddelen.
Introduction
Deze studie beschrijft een voetpad inenting model om de replicatie en verspreiding van virussen te onderzoeken van de PNS naar CNS en de bijbehorende neuro-ontstekingsreacties. Het voetpad inentingsmodel is intensief gebruikt om alfaherpesvirusinfectie in neuronen1,2,,3te bestuderen. Het belangrijkste doel van dit model is om neurotrope virussen om een maximale afstand te reizen door de PNS voor het bereiken van de CNS. Hier wordt dit model gebruikt om nieuwe inzichten te verkrijgen in de ontwikkeling van een bepaalde neuropathie (neuropathische jeuk) bij muizen die besmet zijn met het pseudorabiesvirus (PRV).
PRV is een alfaherpesvirus gerelateerd aan verschillende bekende ziekteverwekkers (d.w.z. herpes simplex type 1 en 2 [HSV1 en HSV2] en varicella-zoster virus [VZV]), die koortsblaasjes, genitale laesies en waterpokken veroorzaken, respectievelijk4. Deze virussen zijn allemaal pantropisch en in staat om veel verschillende celtypes te infecteren zonder affiniteit te tonen voor een specifiek weefseltype. Ze vertonen echter allemaal een karakteristiek neurotropisme door de PNS (en af en toe het CNS) van gastsoorten binnen te vallen. De natuurlijke gastheer is het varken, maar PRV kan de meeste zoogdieren infecteren. In deze niet-natuurlijke gastheren, PRV infecteert de PNS en induceert een ernstige pruritus genaamd de “mad jeuk”, gevolgd door peracute dood5,6. De rol van de neuro-immuunrespons in de klinische uitkomst en pathogenese van PRV-infectie is slecht begrepen.
Het voetpad inentingsmodel stelt PRV in staat om infectie in de opperhuidcellen van het voetpad te starten. Dan, de infectie verspreidt zich in zintuiglijke en sympathische zenuwvezels die innervate de opperhuid, zweetklieren, en dermis. De infectie verspreidt zich door virusdeeltjes die binnen ongeveer 60 uur via de heupzenuw naar de DRG bewegen. De infectie verspreidt zich door het ruggenmerg, uiteindelijk het bereiken van de achterhersenen wanneer dieren stervende raken (82 uur na infectie). Gedurende deze tijd venster, weefsel monsters kunnen worden verzameld, verwerkt, en geanalyseerd voor virus replicatie en markers van de immuunrespons. Bijvoorbeeld, histologisch onderzoek en virale belasting kwantificering kan worden uitgevoerd in verschillende weefsels om correlaties tussen de initiatie en ontwikkeling van klinische, virologische en neuro-inflammatoire processen in PRV pathogenese vast te stellen.
Met behulp van het voetpad inentingsmodel kunnen de cellulaire en moleculaire mechanismen van PRV-geïnduceerde pruritus bij muizen worden onderzocht. Bovendien kan dit model nieuw inzicht geven in de initiatie en ontwikkeling van door virussen geïnduceerde neuro-ontsteking tijdens herpesvirusinfecties. Een beter begrip van de processen die ten grondslag liggen aan alfaherpesvirus-geïnduceerde neuropathieën kan leiden tot de ontwikkeling van innovatieve therapeutische strategieën. Dit model is bijvoorbeeld nuttig om de mechanismen van neuropathische jeuk te onderzoeken bij patiënten met postherpetische laesies (bijvoorbeeld herpes zoster, gordelroos) en nieuwe therapeutische doelen bij muizen te testen op de overeenkomstige menselijke ziekten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hier beschreven voetpad inentingsmodel is nuttig om de initiatie en ontwikkeling van neuro-inflammatoire reacties tijdens alfaherpesvirusinfectie te onderzoeken. Bovendien wordt dit in vivo model gebruikt om de kinetiek van replicatie en verspreiding van alfaherpesvirus van het PNS naar CNS vast te stellen. Dit is een alternatief voor andere inentingsmodellen, zoals het flankhuidinentingsmodel, dat is gebaseerd op diepe huidkrassen13, of de intracraniale route, die het virus rechtstreeks intro…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen Charles River laboratoria voor hun uitstekende technische ondersteuning bij het uitvoeren van de histopathologie analyses. Dit werk werd gefinancierd door het National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (RO1 NS033506 en RO1 NS060699). De financiers hadden geen rol in het ontwerp van de studie, het verzamelen en analyseren van gegevens, het besluit om het manuscript te publiceren of de voorbereiding van het manuscript.
Materials
| Antibody anti-PRV gB | Made by the lab | 1/500 dilution | |
| Aqua-hold2 pap pen red | Fisher scientific | 2886909 | |
| Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files) | Revlon | ||
| Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| C57BL/6 mice (5-7 weeks) | The Jackson Laboratories | ||
| DAPI solution (1mg/ml) | Fisher scientific | 62248 | 1/1000 dilution |
| Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm | Sigma-Aldrich | P5731500 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30022 | |
| Dulbecco's Phophate Buffer Saline (PBS) solution | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30088 | |
| Fine curved scissors stainless steel | FST | 14095-11 | |
| Fluoromount-G mounting media | Fisher scientific | 0100-01 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Microcentrifuge tube 2ml | Denville Scientific | 1000945 | |
| Microtube 1.5ml | SARSTEDT | 72692005 | |
| Negative goat serum | Vector | S-1000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 154022 | |
| Precision Glide needle 18G | BD | 305196 | |
| Razor blades steel back | Personna | 9412071 | |
| RNA lysis buffer (RLT) | Qiagen | 79216 | |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
| Superfrost/plus microscopic slides | Fisher scientific | 12-550-15 | |
| Tissue lyser LT | Qiagen | 69980 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 | |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | 1/2000 dilution |
Riferimenti
- Field, H. J., Hill, T. J. The pathogenesis of pseudorabies in mice following peripheral inoculation. Journal of General Virology. 23 (2), 145-157 (1974).
- Engel, J. P., Madigan, T. C., Peterson, G. M. The transneuronal spread phenotype of herpes simplex virus type 1 infection of the mouse hind footpad. Journal of Virology. 71 (3), 2425-2435 (1997).
- Guedon, J. M., et al. Neuronal changes induced by Varicella Zoster Virus in a rat model of postherpetic neuralgia. Virology. 482, 167-180 (2015).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
- Wittmann, G., Rziha, H. J., Knipe, D. M., Howley, P. M. Aujeszky’s disease (pseudorabies) in pigs. Herpesvirus diseases of cattle, horses and pigs. 9, 230-325 (1989).
- Leman, A. D., Glock, R. D., Mengeling, W. L., Penny, R. H. C., Scholl, E., Straw, B. . Diseases of swine, 6th ed. , 209-223 (1986).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, 82 (2016).
- Sands, S. A., Leung-Toung, R., Wang, Y., Connelly, J., LeVine, S. M. Enhanced Histochemical Detection of Iron in Paraffin Sections of Mouse Central Nervous System Tissue: Application in the APP/PS1 Mouse Model of Alzheimer’s Disease. ASN Neuro. 8 (5), (2016).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Koyuncu, O. O., MacGibeny, M. A., Hogue, I. B., Enquist, L. W. Compartmented neuronal cultures reveal two distinct mechanisms for alpha herpesvirus escape from genome silencing. PLoS pathogens. 13 (10), 1006608 (2017).
- Laval, K., Vernejoul, J. B., Van Cleemput, J., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Virulent Pseudorabies Virus Infection Induces a Specific and Lethal Systemic Inflammatory Response in Mice. Journal of Virology. 92 (24), 01614-01618 (2018).
- Laval, K., Van Cleemput, J., Vernejoul, J. B., Enquist, L. W. Alphaherpesvirus infection of mice primes PNS neurons to an inflammatory state regulated by TLR2 and type I IFN signaling. PLoS Pathogens. 15 (11), 1008087 (2019).
- Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
- Mancini, M., Vidal, S. M. Insights into the pathogenesis of herpes simplex encephalitis from mouse models. Mammalian Genome: Official Journal of the International Mammalian Genome Society. 29 (7-8), 425-445 (2018).
- Kopp, S. J., et al. Infection of neurons and encephalitis after intracranial inoculation of herpes simplex virus requires the entry receptor nectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17916-17920 (2009).
- Wang, J. P., et al. Role of specific innate immune responses in herpes simplex virus infection of the central nervous system. Journal of Virology. 86 (4), 2273-2281 (2012).
- Haberthur, K., Messaoudi, I. Animal models of varicella zoster virus infection. Pathogens. 2 (2), 364-382 (2013).
- Sarova-Pinhas, I., Achiron, A., Gilad, R., Lampl, Y. Peripheral neuropathy in multiple sclerosis: a clinical and electrophysiologic study. Acta Neurologica Scandinavia. 91 (4), 234-238 (1995).
- MacGibeny, M. A., Koyuncu, O. O., Wirblich, C., Schnell, M. J., Enquist, L. W. Retrograde axonal transport of rabies virus is unaffected by interferon treatment but blocked by emetine locally in axons. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007188 (2018).
- Hunsperger, E. A., Roehrig, J. T. Temporal analyses of the neuropathogenesis of a West Nile virus infection in mice. Journal of Neurovirology. 12 (2), 129-139 (2006).
- Swartwout, B. K., et al. Zika Virus Persistently and Productively Infects Primary Adult Sensory Neurons In Vitro. Pathogens. 6 (4), 49 (2017).
- Racaniello, V. R. One hundred years of poliovirus pathogenesis. Virology. 344 (1), 9-16 (2006).
