Maus Footpad Inokulation Modell zur Untersuchung viral-induzierte neuroentzündliche Reaktionen
Summary
Das Footpad-Impfmodell ist ein wertvolles Werkzeug zur Charakterisierung viral-induzierter neuroentzündlicher Reaktionen in vivo. Insbesondere bietet es eine klare Bewertung der viralen Kinetik und der damit verbundenen immunpathologischen Prozesse, die im peripheren Nervensystem eingeleitet wurden.
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt ein Footpad-Impfmodell, das verwendet wird, um die Initiierung und Entwicklung neuroentzündlicher Reaktionen während einer Alphaherpesvirus-Infektion bei Mäusen zu untersuchen. Da Alphaherpesviren Haupteindringlinge des peripheren Nervensystems (PNS) sind, eignet sich dieses Modell, um die Kinetik der Virusreplikation, ihre Ausbreitung von PNS auf ZNS und die damit verbundenen neuroentzündlichen Reaktionen zu charakterisieren. Das Footpad-Impfmodell ermöglicht die Ausbreitung von Viruspartikeln von einer primären Infektionsstelle in der Fußpolsterepidermis auf sensorische und sympathische Nervenfasern, die die Epidermis, Schweißdrüsen und Dermis innervierend beleben. Die Infektion breitet sich über den Ischiasnerv auf die Rückenwurzelganglien (DRG) und schließlich über das Rückenmark zum Gehirn aus. Hier wird ein Maus-Fußpad mit dem Pseudorabivirus (PRV) geimpft, einem Alphaherpesvirus, das eng mit dem Herpes-Simplex-Virus (HSV) und dem Varicella-Zoster-Virus (VZV) verwandt ist. Dieses Modell zeigt, dass PRV-Infektion schwere Entzündungen induziert, gekennzeichnet durch neutrophile Infiltration im Fußpad und DRG. Hohe Konzentrationen von entzündlichen Zytokinen werden anschließend in homogenisierten Geweben per ELISA nachgewiesen. Darüber hinaus wird eine starke Korrelation zwischen PRV-Gen und Proteinexpression (über qPCR und IF-Färbung) in DRG und der Produktion von proinflammatorischen Zytokinen beobachtet. Daher bietet das Footpad-Impfmodell ein besseres Verständnis der Prozesse, die Alphaherpesvirus-induzierten Neuropathien zugrunde liegen, und kann zur Entwicklung innovativer therapeutischer Strategien führen. Darüber hinaus kann das Modell die Forschung zu peripheren Neuropathien, wie Multiple Sklerose und damit verbundenen viral-induzierten Schäden an der PNS, leiten. Letztlich kann es als kostengünstiges In-vivo-Tool für die Arzneimittelentwicklung dienen.
Introduction
Diese Studie beschreibt ein Footpad-Impfmodell, um die Replikation und Ausbreitung von Viren vom PNS auf ZNS und die damit verbundenen neuroinflammatorischen Reaktionen zu untersuchen. Das Footpad-Impfmodell wurde intensiv verwendet, um Alphaherpesvirus-Infektionen in neuronen1,2,3zu untersuchen. Das Hauptziel dieses Modells ist es, neurotrope Viren zu ermöglichen, eine maximale Entfernung durch das PNS zu reisen, bevor sie das ZNS erreichen. Hier wird dieses Modell verwendet, um neue Erkenntnisse über die Entwicklung einer bestimmten Neuropathie (neuropathischer Schreiz) bei Mäusen zu erhalten, die mit dem Pseudorabivirus (PRV) infiziert sind.
PRV ist ein Alphaherpesvirus im Zusammenhang mit mehreren bekannten Krankheitserregern (d. h. Herpes simplex Typ 1 und 2 [HSV1 und HSV2] und Varicella-Zoster-Virus [VZV]), die Erkältungsgeschoren, Genitalläsionen und Windpocken verursachen, bzw.4. Diese Viren sind alle pantrop und in der Lage, viele verschiedene Zelltypen zu infizieren, ohne Affinität für einen bestimmten Gewebetyp zu zeigen. Sie alle weisen jedoch einen charakteristischen Neurotropismus auf, indem sie in die PNS (und gelegentlich auch in die ZNS) der Wirtsarten eindringen. Der natürliche Wirt ist das Schwein, aber PRV kann die meisten Säugetiere infizieren. Bei diesen nicht-natürlichen Wirten infiziert PRV die PNS und induziert einen schweren Pruritus, den “wahnsinnigen Juckreiz”, gefolgt von perakutem Tod5,6. Die Rolle der Neuroimmunantwort im klinischen Ergebnis und der Pathogenese einer PRV-Infektion ist schlecht verstanden worden.
Das Footpad-Impfmodell ermöglicht PRV, infektionen in den epidermalen Zellen des Footpads zu initiieren. Dann breitet sich die Infektion in sensorische und sympathische Nervenfasern aus, die die Epidermis, Schweißdrüsen und Dermis innervierend beleben. Die Infektion breitet sich durch Viruspartikel aus, die sich innerhalb von ca. 60 h über den Ischiasnerv zum DRG bewegen. Die Infektion breitet sich über das Rückenmark aus und erreicht schließlich das Hinterhirn, wenn Tiere moribund werden (82 h nach der Infektion). Während dieses Zeitfensters können Gewebeproben gesammelt, verarbeitet und auf Virusreplikation und Marker der Immunantwort analysiert werden. Beispielsweise können histologische Untersuchungen und virale Lastquantifizierungen in verschiedenen Geweben durchgeführt werden, um Korrelationen zwischen der Einleitung und Entwicklung klinischer, virologischer und neuroinflammatorischer Prozesse bei der PRV-Pathogenese herzustellen.
Mit Hilfe des Footpad-Impfmodells können die zellulären und molekularen Mechanismen des PRV-induzierten Pruritus bei Mäusen untersucht werden. Darüber hinaus kann dieses Modell neue Einblicke in die Initiierung und Entwicklung von virusinduzierten Neuroinflammationen bei Herpesvirus-Infektionen liefern. Ein besseres Verständnis der Prozesse, die Alphaherpesvirus-induzierten Neuropathien zugrunde liegen, kann zur Entwicklung innovativer therapeutischer Strategien führen. Beispielsweise ist dieses Modell nützlich, um die Mechanismen des neuropathischen Schreizes bei Patienten mit postherpetischen Läsionen (z. B. Herpes zoster, Schindeln) zu untersuchen und neuartige therapeutische Ziele bei Mäusen auf die entsprechenden menschlichen Krankheiten zu testen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Footpad-Impfmodell ist nützlich, um die Einleitung und Entwicklung neuroinflammatorischer Reaktionen während einer Alphaherpesvirus-Infektion zu untersuchen. Darüber hinaus wird dieses In-vivo-Modell verwendet, um die Kinetik der Replikation und Ausbreitung des Alphaherpesvirus vom PNS auf DasZ S zu ermitteln. Dies ist eine Alternative zu anderen Impfmodellen, wie dem Flankenhaut-Impfmodell, das auf tiefem dermalen Kratzen13beruht, oder der intrakraniellen Route, die das V…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren würdigen die Laboratorien von Charles River für ihre ausgezeichnete technische Unterstützung bei der Durchführung der histopathologischen Analysen. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (RO1 NS033506 und RO1 NS060699) finanziert. Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Studiengestaltung, Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.
Materials
| Antibody anti-PRV gB | Made by the lab | 1/500 dilution | |
| Aqua-hold2 pap pen red | Fisher scientific | 2886909 | |
| Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files) | Revlon | ||
| Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| C57BL/6 mice (5-7 weeks) | The Jackson Laboratories | ||
| DAPI solution (1mg/ml) | Fisher scientific | 62248 | 1/1000 dilution |
| Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm | Sigma-Aldrich | P5731500 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30022 | |
| Dulbecco's Phophate Buffer Saline (PBS) solution | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30088 | |
| Fine curved scissors stainless steel | FST | 14095-11 | |
| Fluoromount-G mounting media | Fisher scientific | 0100-01 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Microcentrifuge tube 2ml | Denville Scientific | 1000945 | |
| Microtube 1.5ml | SARSTEDT | 72692005 | |
| Negative goat serum | Vector | S-1000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 154022 | |
| Precision Glide needle 18G | BD | 305196 | |
| Razor blades steel back | Personna | 9412071 | |
| RNA lysis buffer (RLT) | Qiagen | 79216 | |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
| Superfrost/plus microscopic slides | Fisher scientific | 12-550-15 | |
| Tissue lyser LT | Qiagen | 69980 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 | |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | 1/2000 dilution |
Riferimenti
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