바이러스 유발 신경 염증 반응을 연구하는 마우스 풋패드 접종 모델
Summary
풋패드 접종 모델은 생체 내에서 바이러스 유발 신경 염증 반응을 특성화하는 데 중요한 도구입니다. 특히, 말초 신경계에서 시작된 바이러스 운동 및 관련 면역 병리학 적 과정에 대한 명확한 평가를 제공한다.
Abstract
이 프로토콜은 마우스에 있는 alphaherpesvirus 감염 도중 신경 선동적인 반응의 개시 그리고 발달을 연구하기 위하여 이용된 발판 접종 모형을 기술합니다. 알파헤르페스바이러스는 말초 신경계(PNS)의 주요 침략자이기 때문에, 이 모델은 바이러스 복제의 운동, PNS에서 CNS로의 확산, 관련 신경염증 반응을 특성화하는 데 적합합니다. 풋패드 접종 모델은 바이러스 입자가 발바닥 표피의 1차 감염 부위에서 표피, 땀샘 및 진피를 내면화하는 감각및 교감 신경 섬유로 확산될 수 있게 합니다. 감염은 등대 근간 (DRG)에 상반신 신경을 통해 궁극적으로 뇌에 척수를 통해 퍼짐. 여기서, 마우스 풋패드는 포진 심플렉스 바이러스(HSV) 및 수두-동물 바이러스(VZV)와 밀접한 관련이 있는 알파헤르페스 바이러스인 의사 바이러스(PRV)로 접종된다. 이 모델은 PRV 감염이 풋패드와 DRG에 호중구 침투를 특징으로 하는 심각한 염증을 유발한다는 것을 보여줍니다. 염증성 사이토카인의 고농도는 ELISA에 의해 균질화 된 조직에서 이후에 검출됩니다. 또한, DRG에서 PRV 유전자와 단백질 발현(qPCR 및 IF 염색을 통해) 및 프로 염증성 사이토카인의 생산 사이에 강한 상관관계가 관찰된다. 따라서, 풋패드 접종 모델은 알파헤르페스바이러스 유도 신경병증의 근본적인 과정을 더 잘 이해하고 혁신적인 치료 전략의 개발로 이어질 수 있다. 또한, 모델은 다발성 경화증 및 PNS에 대한 바이러스 유발 손상과 같은 말초 신경병증에 대한 연구를 안내할 수 있다. 궁극적으로, 그것은 약물 개발을 위한 생체 내 공구에서 비용 효과적인 역할을 할 수 있습니다.
Introduction
이 연구는 PNS에서 CNS 및 관련 신경 염증 반응에 바이러스의 복제 및 확산을 조사하기 위하여 발판 접종 모형을 기술합니다. 풋패드 접종 모델은 뉴런,1,2,23에서알파헤르페스바이러스 감염을 연구하는 데 집중적으로 사용되어 왔다. 이 모델의 주요 목적은 신경 tropic 바이러스 CNS에 도달 하기 전에 PNS를 통해 최대 거리를 여행 할 수 있도록 하는 것입니다. 여기서, 이 모형은 의사 바이러스 (PRV)에 감염된 마우스에 있는 특정 신경병증 (신경병성 가려움)의 발달에 있는 새로운 통찰력을 얻기 위하여 이용됩니다.
PRV는 감기 염증, 생식기 병변 및 수두를 유발하는 몇 가지 잘 알려진 병원체(즉, 헤르페스 심플렉스 타입 1 및 2 [HSV1 및 HSV2] 및 수두-동물 바이러스 [VZV]와 관련된 알파헤르페스바이러스로, 각각4. 이 바이러스는 모두 pantropic 및 특정 조직 유형에 대 한 친화성을 표시 하지 않고 많은 다른 세포 유형을 감염시킬 수. 그러나, 그들은 모두 PNS를 침범 하 여 특징적인 신경 tropism전시 (그리고 때때로, CNS) 호스트 종의. 자연 호스트는 돼지, 하지만 PRV 대부분의 포유류를 감염시킬 수 있습니다. 이러한 비자연적인 숙주에서 PRV는 PNS를 감염시키고 “미친 가려움증”이라고 불리는 심한 소양증을 유도하고, 그 다음에 는 과급성 사망5,,6을유도한다. PRV 감염의 임상 결과 및 병인에 있는 신경 면역 반응의 역할은 제대로 이해되지 않았습니다.
풋패드 접종 모델은 PRV가 풋패드의 표피 세포에서 감염을 개시할 수 있게 한다. 그런 다음, 감염은 표피, 땀샘 및 진피를 내면화하는 감각과 교감 신경 섬유로 퍼집니다. 감염은 약 60 시간 안에 DRG에 상골 신경을 통해 이동하는 바이러스 입자에 의해 퍼짐. 감염은 척수를 통해 퍼집니다, 동물이 moribund될 때 궁극적으로 힌뇌에 도달 (82 시간 감염 후). 이 기간 동안, 조직 샘플은 면역 반응의 바이러스 복제 및 마커를 위해 수집, 처리 및 분석될 수 있다. 예를 들어, 조직학적 검사 및 바이러스 부하 정량화는 PRV 병인의 임상, 바이러스학 및 신경 염증 과정의 개시 및 개발 사이의 상관 관계를 확립하기 위해 다른 조직에서 수행 될 수있다.
발패드 접종 모델을 사용하여, 마우스에서 PRV 유도 소양증의 세포 및 분자 메커니즘을 조사 할 수있다. 더욱이, 이 모형은 헤르페스 바이러스 감염 도중 바이러스 유도한 신경염증의 개시 그리고 발달에 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다. 알파헤르페스바이러스 유도 신경병증의 근본적인 과정에 대한 더 나은 이해는 혁신적인 치료 전략의 개발로 이어질 수 있습니다. 예를 들어, 이 모델은 헤르페스 후 병변 (예를 들어, 헤르페스 조스터, 대상 포진)을 가진 환자에서 신경 병증 가려움증의 메커니즘을 조사하고 해당 인간 질병에 대한 마우스에서 새로운 치료 표적을 테스트하는 데 유용합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명된 풋패드 접종 모델은 알파헤르페스바이러스 감염 시 신경염증 반응의 개시 및 발달을 조사하는 데 유용하다. 더욱이, 이 생체 내 모델은 PNS에서 CNS로 알파헤르페스바이러스의 복제 및 확산의 역학을 확립하는 데 사용된다. 이는 깊은 진피스크래치(13)또는 CNS14,,15,16에바이러스를 직접 도입하는 두개내 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 역사 병리학 분석을 실행하는 우수한 기술 지원에 대한 찰스 강 실험실을 인정합니다. 이 작품은 신경 장애 및 뇌졸중의 국립 연구소에 의해 투자되었다 (NINDS) (RO1 NS033506 및 RO1 NS060699). 기금은 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할이 없었습니다.
Materials
| Antibody anti-PRV gB | Made by the lab | 1/500 dilution | |
| Aqua-hold2 pap pen red | Fisher scientific | 2886909 | |
| Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files) | Revlon | ||
| Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| C57BL/6 mice (5-7 weeks) | The Jackson Laboratories | ||
| DAPI solution (1mg/ml) | Fisher scientific | 62248 | 1/1000 dilution |
| Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm | Sigma-Aldrich | P5731500 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30022 | |
| Dulbecco's Phophate Buffer Saline (PBS) solution | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30088 | |
| Fine curved scissors stainless steel | FST | 14095-11 | |
| Fluoromount-G mounting media | Fisher scientific | 0100-01 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Microcentrifuge tube 2ml | Denville Scientific | 1000945 | |
| Microtube 1.5ml | SARSTEDT | 72692005 | |
| Negative goat serum | Vector | S-1000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 154022 | |
| Precision Glide needle 18G | BD | 305196 | |
| Razor blades steel back | Personna | 9412071 | |
| RNA lysis buffer (RLT) | Qiagen | 79216 | |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
| Superfrost/plus microscopic slides | Fisher scientific | 12-550-15 | |
| Tissue lyser LT | Qiagen | 69980 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 | |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | 1/2000 dilution |
Riferimenti
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