עכבר כרית הרגליים מודל לחקר ויראלי המושרה תגובות נוירודלקתיות
Summary
מודל החיסונים הוא כלי רב ערך לאפיון תגובות נוירודלקתיות המושרה בvivo. בפרט, היא מספקת הערכה ברורה של קינטיקה ויראלית ותהליכים immunopathological משויכים המופעלים במערכת העצבים ההיקפית.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר מודל החיסון לשימוש לימוד ייזום ופיתוח של תגובות נוירודלקתיות במהלך זיהום וירוס אלפא בעכברים. כמו אלפא וירוסים הם הפולשים העיקריים של מערכת העצבים ההיקפית (היקפית), מודל זה מתאים לאפיין את קינטיקה של שכפול נגיפי, התפשטות שלו מ היקפית ל-CN, ותגובות נוירודלקתיות הקשורים. מודל כרית הרגליים מאפשר חלקיקי וירוס להתפשט מאתר זיהום ראשוני באפידרמיס הfootpad לסיבי עצב חושי ואוהד הinnervate את האפידרמיס, בלוטות זיעה, ו dermis. הזיהום מתפשט דרך העצב המגיד לגנגוליה השורש (DRG) ובסופו של דבר דרך חוט השדרה אל המוח. כאן, footpad העכבר הוא מחוסן עם וירוס פסבדו אקראי (PRV), וירוס אלפהרתקרוב הקשורות וירוס הרפס (HSV) אבעבועות רוח-זוסטר וירוס (VZV). מודל זה ממחיש כי זיהום PRV מעורר דלקת חמורה, מאופיין הסתננות נויטרופילים ב footpad ו DRG. ריכוזים גבוהים של ציטוקינים דלקתיים מזוהים לאחר מכן ברקמות הומוגניים על ידי אליסה. בנוסף, מתאם חזק הוא הבחין בין הגן PRV וביטוי חלבון (דרך qPCR ו IF כתמים) ב DRG וייצור ציטוקינים פרו דלקתיים. לכן, מודל החיסון העצמי מספק הבנה טובה יותר של התהליכים הבסיסיים המושרה על ידי הנגיף אלפא, ועלול להוביל לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות. בנוסף, המודל יכול להנחות מחקר על neuropathies היקפית, כגון טרשת נפוצה ונזק המושרה ויראלי הקשורים היקפית. בסופו של דבר, זה יכול לשמש ככלי חסכוני vivo לפיתוח התרופה.
Introduction
מחקר זה מתאר מודל כרית החיסון כדי לחקור את השכפול והתפשטות של וירוסים מ היקפית ל-CN ותגובות נוירודלקתיות הקשורים. מודל footpad החיסון השתמשו באופן אינטנסיבי כדי לחקור את הזיהום וירוס אלפא בנוירונים1,2,3. המטרה העיקרית של מודל זה היא לאפשר וירוסים נוירוטרופי לנסוע במרחק מקסימלי דרך היקפית לפני שהגיע ל-CN. כאן, מודל זה משמש כדי להשיג תובנות חדשות בפיתוח נוירופתיה מסוימת (גירוד נוירופתי) בעכברים נגועים בווירוס פסבדו אקראי (PRV).
PRV היא וירוס אלפא הקשורים מספר פתוגנים ידועים (קרי, הרפס סוג 1 ו 2 [HSV1 and HSV2] ו אבעבועות רוח-zoster וירוס [VZV]), אשר גורמות פצעים קרים, נגעים באברי המין, ואבעבועות עוף, בהתאמה4. וירוסים אלה הם כל pantropic ומסוגל להדביק סוגים רבים של תאים שונים מבלי להציג אהדה עבור סוג הרקמה הספציפית. עם זאת, הם כולם מוצגים נוירוטרוזם אופייני על ידי הפולשים היקפית (ולפעמים, ה-CN) של המינים המארחים. הפונדקאי הטבעי הוא חזיר, אבל PRV יכול להדביק את רוב היונקים. במחשבים מארחים לא טבעיים אלה, prv מדביק את היקפית ומשרה מתחריטוס חמור שנקרא “גירוד מטורף”, ואחריו מוות בחריפות5,6. התפקיד של התגובה נוירוחיסונית בתוצאה הקלינית בפתוגנזה של זיהום PRV כבר הבינו היטב.
מודל החיסון מאפשר PRV ליזום זיהום בתאים באפידרמיס של footpad. לאחר מכן, הזיהום מתפשט לתוך סיבים עצביים חושים וסימפטיים הinnervate את האפידרמיס, בלוטות זיעה, ו dermis. הזיהום מתפשט על ידי חלקיקי וירוס נע דרך העצב הגיד כדי DRG בתוך כ 60 h. הזיהום מתפשט דרך חוט השדרה, בסופו של דבר להגיע המוח המבוקר כאשר בעלי חיים הופכים מורבנד (82 h לאחר ההדבקה). במהלך הזמן הזה חלון, דגימות רקמות ניתן לאסוף, מעובד, וניתח עבור שכפול וירוסים סמנים של התגובה החיסונית. למשל, בדיקה היסטולוגית וכימות העמסה ויראלי ניתן לבצע ברקמות שונות כדי ליצור מערכת יחסים בין ייזום ופיתוח של קליני, virological, ו דלקתיות תהליכים בפתוגנזה PRV.
באמצעות מודל החיסונים, המנגנונים הסלולאריים והמולקולריים של הפרוריטוס המושרה בעכברים ניתן לחקור. יתר על כן, מודל זה יכול לספק תובנה חדשה לתוך ייזום ופיתוח של דלקת נוירודלקתיות המושרה במהלך דלקות הרפס. הבנה טובה יותר של התהליכים הבסיסיים המושרה על ידי הנגיף האנטי-וירוס עלולה להוביל לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות. למשל, מודל זה שימושי כדי לחקור את המנגנונים של גירוד נוירופתי בחולים עם נגעים פוסט herpetic (למשל, הרפס zoster, רעפים) ולבדוק מטרות טיפוליות הרומן בעכברים עבור מחלות האדם המקביל.
Protocol
Representative Results
Discussion
מודל החיסונים שמתואר כאן הוא שימושי כדי לחקור את ייזום ופיתוח של תגובות נוירודלקתיות במהלך זיהום וירוס אלפא. יתר על כן, זה במודל vivo משמש כדי ליצור את קינטיקה של שכפול והתפשטות של אלפא וירוס מהיקפית ל-CN. זהו חלופה לדגמים אחרים, כגון העור אגף החיסון, אשר מסתמך על גירוד בעורי עמוק13…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מכירים במעבדות של שארל ריבר על התמיכה הטכנית המצוינת שלהם ביצוע ניתוחי histopathology. עבודה זו ממומנת על ידי המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות שבץ (NINDS) (RO1 NS033506 ו RO1 NS060699). לתורמים לא היה כל תפקיד בתכנון לימוד, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.
Materials
| Antibody anti-PRV gB | Made by the lab | 1/500 dilution | |
| Aqua-hold2 pap pen red | Fisher scientific | 2886909 | |
| Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files) | Revlon | ||
| Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| C57BL/6 mice (5-7 weeks) | The Jackson Laboratories | ||
| DAPI solution (1mg/ml) | Fisher scientific | 62248 | 1/1000 dilution |
| Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm | Sigma-Aldrich | P5731500 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30022 | |
| Dulbecco's Phophate Buffer Saline (PBS) solution | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30088 | |
| Fine curved scissors stainless steel | FST | 14095-11 | |
| Fluoromount-G mounting media | Fisher scientific | 0100-01 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Microcentrifuge tube 2ml | Denville Scientific | 1000945 | |
| Microtube 1.5ml | SARSTEDT | 72692005 | |
| Negative goat serum | Vector | S-1000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 154022 | |
| Precision Glide needle 18G | BD | 305196 | |
| Razor blades steel back | Personna | 9412071 | |
| RNA lysis buffer (RLT) | Qiagen | 79216 | |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
| Superfrost/plus microscopic slides | Fisher scientific | 12-550-15 | |
| Tissue lyser LT | Qiagen | 69980 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 | |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | 1/2000 dilution |
Riferimenti
- Field, H. J., Hill, T. J. The pathogenesis of pseudorabies in mice following peripheral inoculation. Journal of General Virology. 23 (2), 145-157 (1974).
- Engel, J. P., Madigan, T. C., Peterson, G. M. The transneuronal spread phenotype of herpes simplex virus type 1 infection of the mouse hind footpad. Journal of Virology. 71 (3), 2425-2435 (1997).
- Guedon, J. M., et al. Neuronal changes induced by Varicella Zoster Virus in a rat model of postherpetic neuralgia. Virology. 482, 167-180 (2015).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
- Wittmann, G., Rziha, H. J., Knipe, D. M., Howley, P. M. Aujeszky’s disease (pseudorabies) in pigs. Herpesvirus diseases of cattle, horses and pigs. 9, 230-325 (1989).
- Leman, A. D., Glock, R. D., Mengeling, W. L., Penny, R. H. C., Scholl, E., Straw, B. . Diseases of swine, 6th ed. , 209-223 (1986).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, 82 (2016).
- Sands, S. A., Leung-Toung, R., Wang, Y., Connelly, J., LeVine, S. M. Enhanced Histochemical Detection of Iron in Paraffin Sections of Mouse Central Nervous System Tissue: Application in the APP/PS1 Mouse Model of Alzheimer’s Disease. ASN Neuro. 8 (5), (2016).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Koyuncu, O. O., MacGibeny, M. A., Hogue, I. B., Enquist, L. W. Compartmented neuronal cultures reveal two distinct mechanisms for alpha herpesvirus escape from genome silencing. PLoS pathogens. 13 (10), 1006608 (2017).
- Laval, K., Vernejoul, J. B., Van Cleemput, J., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Virulent Pseudorabies Virus Infection Induces a Specific and Lethal Systemic Inflammatory Response in Mice. Journal of Virology. 92 (24), 01614-01618 (2018).
- Laval, K., Van Cleemput, J., Vernejoul, J. B., Enquist, L. W. Alphaherpesvirus infection of mice primes PNS neurons to an inflammatory state regulated by TLR2 and type I IFN signaling. PLoS Pathogens. 15 (11), 1008087 (2019).
- Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
- Mancini, M., Vidal, S. M. Insights into the pathogenesis of herpes simplex encephalitis from mouse models. Mammalian Genome: Official Journal of the International Mammalian Genome Society. 29 (7-8), 425-445 (2018).
- Kopp, S. J., et al. Infection of neurons and encephalitis after intracranial inoculation of herpes simplex virus requires the entry receptor nectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17916-17920 (2009).
- Wang, J. P., et al. Role of specific innate immune responses in herpes simplex virus infection of the central nervous system. Journal of Virology. 86 (4), 2273-2281 (2012).
- Haberthur, K., Messaoudi, I. Animal models of varicella zoster virus infection. Pathogens. 2 (2), 364-382 (2013).
- Sarova-Pinhas, I., Achiron, A., Gilad, R., Lampl, Y. Peripheral neuropathy in multiple sclerosis: a clinical and electrophysiologic study. Acta Neurologica Scandinavia. 91 (4), 234-238 (1995).
- MacGibeny, M. A., Koyuncu, O. O., Wirblich, C., Schnell, M. J., Enquist, L. W. Retrograde axonal transport of rabies virus is unaffected by interferon treatment but blocked by emetine locally in axons. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007188 (2018).
- Hunsperger, E. A., Roehrig, J. T. Temporal analyses of the neuropathogenesis of a West Nile virus infection in mice. Journal of Neurovirology. 12 (2), 129-139 (2006).
- Swartwout, B. K., et al. Zika Virus Persistently and Productively Infects Primary Adult Sensory Neurons In Vitro. Pathogens. 6 (4), 49 (2017).
- Racaniello, V. R. One hundred years of poliovirus pathogenesis. Virology. 344 (1), 9-16 (2006).
