वायरल प्रेरित न्यूरोइनफ्लैम्परी प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए माउस फुटपैड टीका मॉडल
Summary
फुटपैड टीका मॉडल वीवो में वायरल-प्रेरित न्यूरोइंफ्लैमेटरी प्रतिक्रियाओं की विशेषता के लिए एक मूल्यवान उपकरण है। विशेष रूप से, यह परिधीय तंत्रिका तंत्र में शुरू की गई वायरल काइनेटिक्स और संबद्ध इम्यूनोपैथोलॉजिकल प्रक्रियाओं का स्पष्ट आकलन प्रदान करता है।
Abstract
यह प्रोटोकॉल चूहों में अल्फाहेरपेसवायरस संक्रमण के दौरान न्यूरोइंफ्लेमेटरी प्रतिक्रियाओं की दीक्षा और विकास का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले फुटपैड टीका मॉडल का वर्णन करता है। चूंकि अल्फाहेर्प्सवायरस परिधीय तंत्रिका तंत्र (पीएनएस) के मुख्य आक्रमणकारी हैं, यह मॉडल वायरल प्रतिकृति के काइनेटिक्स की विशेषता के लिए उपयुक्त है, पीएनएस से सीएनएस तक इसका फैलाव, और संबद्ध न्यूरोइंफ्लेमेटरी प्रतिक्रियाएं। फुटपैड टीका मॉडल वायरस कणों को फुटपैड एपिडर्मिस में प्राथमिक संक्रमण स्थल से संवेदी और सहानुभूतिपूर्ण तंत्रिका फाइबर तक फैलने की अनुमति देता है जो एपिडर्मिस, पसीने की ग्रंथियों और डर्मिस को आंतरिक रूप देते हैं। संक्रमण सियाटिक तंत्रिका के माध्यम से पृष्ठीय जड़ गैंगलिया (डीआरजी) और अंततः रीढ़ की हड्डी के माध्यम से मस्तिष्क में फैलता है। यहां, एक माउस फुटपैड को छद्म वायरस (पीआरवी) के साथ टीका लगाया जाता है, जो दाद सिंप्लेक्स वायरस (एचएसवी) और वेरिकेला-ज़ोस्टर वायरस (वीजेडवी) से निकटता से संबंधित एक अल्फाहेर्प्सवायरस है। यह मॉडल दर्शाता है कि पीआरवी संक्रमण गंभीर सूजन को प्रेरित करता है, जो फुटपैड और डीआरजी में न्यूट्रोफिल घुसपैठ की विशेषता है। बाद में एलिसा द्वारा समरूप ऊतकों में भड़काऊ साइटोकिन्स की उच्च सांद्रता का पता लगाया जाता है। इसके अलावा, डीआरजी में पीआरवी जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति (क्यूपीसीआर और यदि धुंधला के माध्यम से) और समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स के उत्पादन के बीच एक मजबूत सहसंबंध देखा जाता है। इसलिए, फुटपैड टीका मॉडल अल्फाहेरपेसवायरस-प्रेरित न्यूरोपैथी में अंतर्निहित प्रक्रियाओं की बेहतर समझ प्रदान करता है और अभिनव चिकित्सीय रणनीतियों के विकास का कारण बन सकता है। इसके अलावा, मॉडल परिधीय न्यूरोपैथी पर अनुसंधान का मार्गदर्शन कर सकता है, जैसे कि मल्टीपल स्क्लेरोसिस और पीएनएस को संबद्ध वायरल-प्रेरित क्षति। अंततः, यह दवा के विकास के लिए वीवो उपकरण में लागत प्रभावी के रूप में काम कर सकता है।
Introduction
यह अध्ययन पीएनएस से सीएनएस और संबद्ध न्यूरोइंफ्लैमेटरी प्रतिक्रियाओं में वायरस की प्रतिकृति और प्रसार की जांच करने के लिए एक फुटपैड टीका मॉडल का वर्णन करता है। पैरों के टीका लगाने वाले मॉडल का उपयोग न्यूरॉन्स 1,2,,3में अल्फाहेर्पसवायरस संक्रमण का अध्ययन करने के लिए किया गया है ।3 इस मॉडल का मुख्य उद्देश्य न्यूरोट्रोपिक वायरस को सीएनएस तक पहुंचने से पहले पीएनएस के माध्यम से अधिकतम दूरी की यात्रा करने की अनुमति देना है। यहां, इस मॉडल का उपयोग छद्म वायरस (पीआरवी) से संक्रमित चूहों में एक विशेष न्यूरोपैथी (न्यूरोपैथिक खुजली) के विकास में नई अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए किया जाता है।
पीआरवी कई प्रसिद्ध रोगजनकों (यानी, दाद सिंप्लेक्स टाइप 1 और 2 [एचएसवी 1 और एचएसवी 2] और वेरिकेला-ज़ोस्टर वायरस [वीजेडवी] से संबंधित एक अल्फाहेरपेसवायरस है, जो क्रमशः4ठंडे घावों, जननांग घावों और चिकन पॉक्स का कारण बनता है। ये वायरस सभी पैनट्रॉपिक होते हैं और एक विशिष्ट ऊतक प्रकार के लिए आत्मीयता दिखाए बिना कई अलग-अलग सेल प्रकारों को संक्रमित करने में सक्षम होते हैं। हालांकि, वे सभी मेजबान प्रजातियों के पीएनएस (और कभी-कभी, सीएनएस) पर हमला करके एक विशेषता न्यूरोट्रोपिज्म प्रदर्शित करते हैं। प्राकृतिक मेजबान सुअर है, लेकिन पीआरवी सबसे स्तनधारियों को संक्रमित कर सकते हैं । इन गैर-प्राकृतिक मेजबानों में, पीआरवी पीएनएस को संक्रमित करता है और “मैड खुजली” नामक एक गंभीर प्रेटिटस को प्रेरित करता है, जिसके बाद पेराक्यूट डेथ5,,6होती है। पीआरवी संक्रमण के नैदानिक परिणाम और रोगजनन में न्यूरोइम्यून प्रतिक्रिया की भूमिका को खराब समझा गया है।
फुटपैड टीका मॉडल पीआरवी को फुटपैड की एपिडर्मल कोशिकाओं में संक्रमण शुरू करने की अनुमति देता है। फिर, संक्रमण संवेदी और सहानुभूति तंत्रिका फाइबर में फैलता है जो एपिडर्मिस, पसीने की ग्रंथियों और डर्मिस को आंतरिक रूप देते हैं। संक्रमण लगभग 60 घंटे के भीतर डीआरजी के लिए sciatic तंत्रिका के माध्यम से चलती वायरस कणों से फैलता है। संक्रमण रीढ़ की हड्डी के माध्यम से फैलता है, अंततः हिंडब्रेन तक पहुंच जब जानवर मरणासन्न (82 घंटे के बाद संक्रमण) हो जाते हैं। इस समय खिड़की के दौरान, ऊतक के नमूनों को एकत्र किया जा सकता है, संसाधित किया जा सकता है, और वायरस प्रतिकृति और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के मार्कर के लिए विश्लेषण किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, पीआरवी रोगजनकता में नैदानिक, विषाणुविज्ञान और न्यूरोइंफ्लैमेटरी प्रक्रियाओं की दीक्षा और विकास के बीच सहसंबंध स्थापित करने के लिए विभिन्न ऊतकों में हिस्टोलॉजिकल परीक्षा और वायरल लोड क्वांटिफिकेशन किया जा सकता है।
फुटपैड टीका मॉडल का उपयोग करके, चूहों में पीआरवी-प्रेरित प्रेट्रिटी के सेलुलर और आणविक तंत्र की जांच की जा सकती है। इसके अलावा, यह मॉडल दाद वायरस संक्रमण के दौरान वायरस प्रेरित न्यूरोइनफ्लेमेशन की दीक्षा और विकास में नई अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। अल्फाहेरपेसवायरस-प्रेरित न्यूरोपैथी में अंतर्निहित प्रक्रियाओं की बेहतर समझ अभिनव चिकित्सीय रणनीतियों के विकास का कारण बन सकती है। उदाहरण के लिए, यह मॉडल पोस्ट-हर्पेटिक घावों (जैसे, दाद जोस्टर, दाद) और इसी मानव रोगों के लिए चूहों में उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्यों का परीक्षण करने वाले रोगियों में न्यूरोपैथिक खुजली के तंत्र की जांच करने के लिए उपयोगी है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित फुटपैड टीका मॉडल अल्फाहेरपेसवायरस संक्रमण के दौरान न्यूरोइंफ्लेमेटरी प्रतिक्रियाओं की दीक्षा और विकास की जांच करने के लिए उपयोगी है। इसके अलावा, वीवो मॉडल में इसका उपयोग पीएनएस से सीएन?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक हिस्टोपैथोलॉजी विश्लेषणों को निष्पादित करने वाले उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए चार्ल्स नदी प्रयोगशालाओं को स्वीकार करते हैं। इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डर्स एंड स्ट्रोक (एनआईएनएस) (आरओ1 एनएस033506 और आरओ1 एनएस060699) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। फंडर्स की अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने या पांडुलिपि तैयार करने के निर्णय में कोई भूमिका नहीं थी।
Materials
| Antibody anti-PRV gB | Made by the lab | 1/500 dilution | |
| Aqua-hold2 pap pen red | Fisher scientific | 2886909 | |
| Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files) | Revlon | ||
| Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| C57BL/6 mice (5-7 weeks) | The Jackson Laboratories | ||
| DAPI solution (1mg/ml) | Fisher scientific | 62248 | 1/1000 dilution |
| Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm | Sigma-Aldrich | P5731500 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30022 | |
| Dulbecco's Phophate Buffer Saline (PBS) solution | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30088 | |
| Fine curved scissors stainless steel | FST | 14095-11 | |
| Fluoromount-G mounting media | Fisher scientific | 0100-01 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Microcentrifuge tube 2ml | Denville Scientific | 1000945 | |
| Microtube 1.5ml | SARSTEDT | 72692005 | |
| Negative goat serum | Vector | S-1000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 154022 | |
| Precision Glide needle 18G | BD | 305196 | |
| Razor blades steel back | Personna | 9412071 | |
| RNA lysis buffer (RLT) | Qiagen | 79216 | |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
| Superfrost/plus microscopic slides | Fisher scientific | 12-550-15 | |
| Tissue lyser LT | Qiagen | 69980 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 | |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | 1/2000 dilution |
Riferimenti
- Field, H. J., Hill, T. J. The pathogenesis of pseudorabies in mice following peripheral inoculation. Journal of General Virology. 23 (2), 145-157 (1974).
- Engel, J. P., Madigan, T. C., Peterson, G. M. The transneuronal spread phenotype of herpes simplex virus type 1 infection of the mouse hind footpad. Journal of Virology. 71 (3), 2425-2435 (1997).
- Guedon, J. M., et al. Neuronal changes induced by Varicella Zoster Virus in a rat model of postherpetic neuralgia. Virology. 482, 167-180 (2015).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
- Wittmann, G., Rziha, H. J., Knipe, D. M., Howley, P. M. Aujeszky’s disease (pseudorabies) in pigs. Herpesvirus diseases of cattle, horses and pigs. 9, 230-325 (1989).
- Leman, A. D., Glock, R. D., Mengeling, W. L., Penny, R. H. C., Scholl, E., Straw, B. . Diseases of swine, 6th ed. , 209-223 (1986).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, 82 (2016).
- Sands, S. A., Leung-Toung, R., Wang, Y., Connelly, J., LeVine, S. M. Enhanced Histochemical Detection of Iron in Paraffin Sections of Mouse Central Nervous System Tissue: Application in the APP/PS1 Mouse Model of Alzheimer’s Disease. ASN Neuro. 8 (5), (2016).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Koyuncu, O. O., MacGibeny, M. A., Hogue, I. B., Enquist, L. W. Compartmented neuronal cultures reveal two distinct mechanisms for alpha herpesvirus escape from genome silencing. PLoS pathogens. 13 (10), 1006608 (2017).
- Laval, K., Vernejoul, J. B., Van Cleemput, J., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Virulent Pseudorabies Virus Infection Induces a Specific and Lethal Systemic Inflammatory Response in Mice. Journal of Virology. 92 (24), 01614-01618 (2018).
- Laval, K., Van Cleemput, J., Vernejoul, J. B., Enquist, L. W. Alphaherpesvirus infection of mice primes PNS neurons to an inflammatory state regulated by TLR2 and type I IFN signaling. PLoS Pathogens. 15 (11), 1008087 (2019).
- Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
- Mancini, M., Vidal, S. M. Insights into the pathogenesis of herpes simplex encephalitis from mouse models. Mammalian Genome: Official Journal of the International Mammalian Genome Society. 29 (7-8), 425-445 (2018).
- Kopp, S. J., et al. Infection of neurons and encephalitis after intracranial inoculation of herpes simplex virus requires the entry receptor nectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17916-17920 (2009).
- Wang, J. P., et al. Role of specific innate immune responses in herpes simplex virus infection of the central nervous system. Journal of Virology. 86 (4), 2273-2281 (2012).
- Haberthur, K., Messaoudi, I. Animal models of varicella zoster virus infection. Pathogens. 2 (2), 364-382 (2013).
- Sarova-Pinhas, I., Achiron, A., Gilad, R., Lampl, Y. Peripheral neuropathy in multiple sclerosis: a clinical and electrophysiologic study. Acta Neurologica Scandinavia. 91 (4), 234-238 (1995).
- MacGibeny, M. A., Koyuncu, O. O., Wirblich, C., Schnell, M. J., Enquist, L. W. Retrograde axonal transport of rabies virus is unaffected by interferon treatment but blocked by emetine locally in axons. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007188 (2018).
- Hunsperger, E. A., Roehrig, J. T. Temporal analyses of the neuropathogenesis of a West Nile virus infection in mice. Journal of Neurovirology. 12 (2), 129-139 (2006).
- Swartwout, B. K., et al. Zika Virus Persistently and Productively Infects Primary Adult Sensory Neurons In Vitro. Pathogens. 6 (4), 49 (2017).
- Racaniello, V. R. One hundred years of poliovirus pathogenesis. Virology. 344 (1), 9-16 (2006).
