Mouse Footpad Modello di inoculazione per studiare risposte neuroinfiammatorie indotte da virus
Summary
Il modello di inoculazione del footpad è uno strumento prezioso per caratterizzare le risposte neuroinfiammatorie indotte da virali in vivo. In particolare, fornisce una valutazione chiara della cinetica virale e dei processi immunopatologici associati avviati nel sistema nervoso periferico.
Abstract
Questo protocollo descrive un modello di inoculazione del footpad utilizzato per studiare l’avvio e lo sviluppo di risposte neuroinfiammatorie durante l’infezione da alfaherpesvirus nei topi. Poiché gli alfaherppi sono i principali invasori del sistema nervoso periferico (PNS), questo modello è adatto a caratterizzare la cinetica della replicazione virale, la sua diffusione dal PNS al SNC e le risposte neuroinfiammatorie associate. Il modello di inoculazione del footpad consente alle particelle di virus di diffondersi da un sito di infezione primaria nell’epidermide del footpad alle fibre nervose sensoriali e simpatiche che innervano l’epidermide, le ghiandole sudoripare e la dermide. L’infezione si diffonde attraverso il nervo sciatico ai gangli della radice dorsale (DRG) e, infine, attraverso il midollo spinale al cervello. Qui, un piede di topo è inoculato con pseudorabies virus (PRV), un virus alfaherpesvirus strettamente correlato al virus dell’herpes simplex (HSV) e del virus varicella-zoster . Questo modello dimostra che l’infezione da PRV induce una grave infiammazione, caratterizzata da infiltrazione di neutrofili nel footpad e DRG. Alte concentrazioni di citochine infiammatorie vengono successivamente rilevate nei tessuti omogeneizzati da ELISA. Inoltre, si osserva una forte correlazione tra l’espressione genica e proteica PRV (tramite qPCR e colorazione IF) nella DRG e la produzione di citochine pro-infiammatorie. Pertanto, il modello di inoculazione del footpad fornisce una migliore comprensione dei processi alla base delle neuropatie indotte da alfaancorato e può portare allo sviluppo di strategie terapeutiche innovative. Inoltre, il modello può guidare la ricerca sulle neuropatie periferiche, come la sclerosi multipla e il danno ai virali associato al PNS. In definitiva, può servire come uno strumento in vivo conveniente per lo sviluppo di farmaci.
Introduction
Questo studio descrive un modello di inoculazione del footpad per studiare la replica e la diffusione dei virus dal PNS al SNC e le risposte neuroinfiammatorie associate. Il modello di inoculazione del footpad è stato utilizzato intensamente per studiare l’infezione da alfaherpesvirus nei neuroni1,2,3. L’obiettivo principale di questo modello è quello di consentire ai virus neurotropici di percorrere una distanza massima attraverso il PNS prima di raggiungere il SNC. Qui, questo modello viene utilizzato per ottenere nuove intuizioni nello sviluppo di un particolare neuropatia (prurito neuropatico) in topi infettati da pseudorabies virus (PRV).
Il PRV è un alfaintovirus correlato a diversi patogeni ben noti (cioè herpes simplex di tipo 1 e 2 [HSV1 e HSV2] e virus varicella-zoster [VV]), che causano herpivi di freddo, lesioni genitali e varicella, rispettivamente4. Questi virus sono tutti pantropici e in grado di infettare molti diversi tipi di cellule senza mostrare affinità per un tipo di tessuto specifico. Tuttavia, tutti presentano un caratteristico neurotropismo invadendo il PNS (e occasionalmente, il CNS) delle specie ospiti. L’ospite naturale è il maiale, ma il PRV può infettare la maggior parte dei mammiferi. In questi ospiti non naturali, PRV infetta il PNS e induce un forte prurito chiamato “prurito pazzo”, seguito da morte peracuta5,6. Il ruolo della risposta neuroimmune nell’esito clinico e nella patogenesi dell’infezione da PRV è stato poco compreso.
Il modello di inoculazione del footpad consente a PRV di avviare l’infezione nelle cellule epidermiche del footpad. Quindi, l’infezione si diffonde in fibre nervose sensoriali e simpatiche che innervano l’epidermide, le ghiandole sudoripare e il derma. L’infezione si diffonde da particelle di virus che si muovono attraverso il nervo sciatico al DRG entro circa 60 h. L’infezione si diffonde attraverso il midollo spinale, raggiungendo infine il cervello posteriore quando gli animali diventano moribondi (82 h dopo l’infezione). Durante questa finestra temporale, i campioni di tessuto possono essere raccolti, elaborati e analizzati per la replicazione del virus e marcatori della risposta immunitaria. Ad esempio, l’esame istologico e la quantificazione del carico virale possono essere eseguiti in diversi tessuti per stabilire correlazioni tra l’avvio e lo sviluppo di processi clinici, virologici e nevrinfiammatori nella patogenesi PRV.
Utilizzando il modello di inoculazione del pedebole, è possibile studiare i meccanismi cellulari e molecolari del prurito indotta da PRV nei topi. Inoltre, questo modello può fornire nuove informazioni sull’avvio e lo sviluppo di neuroinfiammazioni indotte da virus durante le infezioni da herpesvirus. Una migliore comprensione dei processi alla base delle neuropatie indotte dall’alfadante può portare allo sviluppo di strategie terapeutiche innovative. Ad esempio, questo modello è utile per studiare i meccanismi del prurito neuropatico nei pazienti con lesioni post-epetiche (ad esempio, herpes zoster, heringles) e testare nuovi bersagli terapeutici nei topi per le corrispondenti malattie umane.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il modello di inoculazione del footpad descritto qui è utile per studiare l’avvio e lo sviluppo di risposte neuroinfiammatorie durante l’infezione da alfaherpesvirus. Inoltre, questo modello in vivo viene utilizzato per stabilire la cinetica della replicazione e la diffusione di alfaherpesvirus dal PNS al SNC. Si tratta di un’alternativa ad altri modelli di inoculazione, come il modello di inoculazione della pelle del fianco, che si basa su graffi dermici profondi13, o il percorso intracranico, c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono i laboratori Charles River per il loro eccellente supporto tecnico nell’esecuzione delle analisi istopatologiche. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (RO1 NS033506 e RO1 NS060699). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell’analisi dei dati, nella decisione di pubblicazione o nella preparazione del manoscritto.
Materials
| Antibody anti-PRV gB | Made by the lab | 1/500 dilution | |
| Aqua-hold2 pap pen red | Fisher scientific | 2886909 | |
| Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files) | Revlon | ||
| Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| C57BL/6 mice (5-7 weeks) | The Jackson Laboratories | ||
| DAPI solution (1mg/ml) | Fisher scientific | 62248 | 1/1000 dilution |
| Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm | Sigma-Aldrich | P5731500 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30022 | |
| Dulbecco's Phophate Buffer Saline (PBS) solution | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30088 | |
| Fine curved scissors stainless steel | FST | 14095-11 | |
| Fluoromount-G mounting media | Fisher scientific | 0100-01 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Microcentrifuge tube 2ml | Denville Scientific | 1000945 | |
| Microtube 1.5ml | SARSTEDT | 72692005 | |
| Negative goat serum | Vector | S-1000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 154022 | |
| Precision Glide needle 18G | BD | 305196 | |
| Razor blades steel back | Personna | 9412071 | |
| RNA lysis buffer (RLT) | Qiagen | 79216 | |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
| Superfrost/plus microscopic slides | Fisher scientific | 12-550-15 | |
| Tissue lyser LT | Qiagen | 69980 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 | |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | 1/2000 dilution |
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