Voorbereiding van adipose voorlopercellen van muis epididymale vetweefsels
Summary
We presenteren een eenvoudige methode om zeer levensvatbare adipose voorlopercellen te isoleren van epididymale vetkussens van muizen met behulp van fluorescentie geactiveerde celsortering.
Abstract
Obesitas en metabole stoornissen zoals diabetes, hartaandoeningen en kanker worden allemaal geassocieerd met dramatische aanpassing van vetweefsel. Weefsel-ingezeten adipose voorlopercellen (APC’s) spelen een sleutelrol in vetweefsel homeostase en kunnen bijdragen aan de weefselpathologie. Het toenemende gebruik van eencellige analysetechnologieën – waaronder eencellige RNA-sequencing en enkelcellige proteomics – transformeert het stam/voorlopercelveld door een ongekende oplossing van individuele celexpressieveranderingen mogelijk te maken in de context van populatie- of weefselbrede veranderingen. In dit artikel bieden we gedetailleerde protocollen om epididymaal vetweefsel van muizen te ontleden, enkele van vetweefsel afgeleide cellen te isoleren en fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) uit te voeren om te verrijken voor levensvatbare Sca1+/ CD31–/ CD45–/ Ter119– APC’s. Deze protocollen stellen onderzoekers in staat om hoogwaardige APC’s voor te bereiden die geschikt zijn voor downstream-analyses zoals eencellige RNA-sequencing.
Introduction
Vetweefsel speelt een belangrijke rol in het energiemetabolisme. Overtollige energie wordt opgeslagen in de vorm van lipiden en vetweefsel kan aanzienlijk worden uitgebreid of ingetrokken, afhankelijk van de voedingstoestand en de energetische vraag. Uitbreiding van vetweefsel kan het gevolg zijn van een toename van de adipocytengrootte (hypertrofie) en/of van een toename van het aantal adipocyten (hyperplasie); het laatste proces strak gereguleerd door proliferatie en differentiatie van adipose voorlopercellen1,2. Tijdens obesitas breidt vetweefsel zich overmatig uit en ontwikkelt weefseldisfunctie – waaronder hypoxie, ontsteking en insulineresistentie – vaak3,4. Deze complicaties zijn risicofactoren voor veel chronische ziekten, waaronder hypertensie, diabetes, hart- en vaatziekten, beroerte en kanker5. Daarom zijn het beperken van ongecontroleerde uitzetting van vetweefsel en het beperken van vetweefselpathologieën topprioriteiten voor biomedisch onderzoek. Tijdens de uitzetting van vetweefsel verspreiden en differentiëren ingezeten vetweefsel-afgeleide stamcellen (ASC’s) zich en differentiëren ze opeenvolgend in preadipocyten (geëngageerde voorlopercellen) en vervolgens in volwassen adipocyten6. Recente eencellige RNA-sequencing (scRNA-seq) studies tonen aan dat deze adipose progenitor cell (APC) populaties (ASC ‘s en preadipocyten) aanzienlijke moleculaire en functionele heterogeniteitvertonen 7,8,9,10,11,12. Asc’s vertonen bijvoorbeeld een verminderde adipogene differentiatiecapaciteit, terwijl ze ook hogere proliferatie- en uitbreidingsmogelijkheden vertonen in vergelijking met preadipocyten7. Verdere moleculaire verschillen worden gerapporteerd binnen ASC- en preadipocytenpopulaties, hoewel de functionele relevantie van deze verschillen onduidelijk blijft7. Samen benadrukken deze gegevens de complexiteit van de adipose-voorlopercelpool en onderstrepen ze de noodzaak om tools te ontwikkelen en te standaardiseren om deze kritieke celpopulaties beter te begrijpen en te manipuleren.
Dit protocol beschrijft de isolatie van Sca1 met een hoge levensvatbaarheid+ adiposevoorlopercelpopulaties van muisepdidymale vetkussens die geschikt zijn voor gevoelige downstreamanalyses, waaronder eencellige studies (scRNA-sequencing) en celkweek. Isolatie en dissociatie van epididymale vetkussens werd uitgevoerd zoals eerder beschreven7,13 met kleine wijzigingen die de levensvatbaarheid van geïsoleerde APC’s verbeteren. Kortom, gescheiden cellen van epididymale vetkussens zijn gekleurd met antilichamen tegen Sca1, een marker voor zowel ASC’s als preadipocyten6,7en andere afstammingsmarkers (Lin): Ter119 (erythroidcellen), CD31 (endotheelcellen) en CD45 (leukocyten). Levensvatbare Sca1+/Ter119–/CD31–/CD45–/DAPI– cellen worden vervolgens gesorteerd op fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS). Belangrijk is dat dit protocol werd gevalideerd door succesvolle isolatie en analyse van levensvatbare Sca1+/Lin– vetvoorlopercellen gerapporteerd in een recente eencellige RNA-sequencingstudie die functioneel heterogene subpopulaties binnen ASC’s en preadipocyten7identificeerde .
Protocol
Representative Results
Discussion
Single cell RNA sequencing (scRNA-seq) wint snel aan tractie als een krachtig hulpmiddel om tegelijkertijd diverse celpopulaties op het niveau van één cel te bestuderen. Vanwege de hoge kosten in verband met monstervoorbereiding en sequencing met hoge doorvoer, is het noodzakelijk om cellulaire ingangen (hoge levensvatbaarheid en zuiverheid) te optimaliseren om de kans op experimenteel succes te vergroten. Sommige celvoorbereidingsprotocollen zijn gebaseerd op verwijdering van dode cellen en puin met behulp van wasbeur…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We erkennen de Mayo Clinic Microscopy Cell Analysis Core Flow Cytometry Facility voor hulp bij FACS-sortering.
Materials
| 1.7 mL microcentrifuge tube | VWR | 87003-294 | |
| 13 mL culture tube | Thermo Fisher Scientific | 50-809-216 | |
| 15 mL conical tube | Greiner Bio-one | 188 271 | |
| 5 mL test tube with cell strainer snap cap | Thermo Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| 50 mL conical tube | Greiner Bio-one | 227 261 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Anti-CD31-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-519 | |
| Anti-CD45-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-491 | |
| Anti-Sca1-APC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-833 | |
| Anti-Ter119-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-112-908 | |
| BSA | Gold Biotechnology | A-420-500 | |
| Collagenase type II | Thermo Fisher Scientific | 17101-015 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | |
| FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Propidium iodide solution | Miltenyi Biotec | 130-093-233 |
Riferimenti
- Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution. The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).
- Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).
- Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).
- Halberg, N., et al. Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue. Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).
- Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C. Obesity as a Disease. Medical Clinics of North America. 102, 13-33 (2018).
- Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future. Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).
- Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling. Life Science Alliance. 2, 201900561 (2019).
- Burl, R. B., et al. Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling. Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).
- Hepler, C., et al. Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice. eLife. 7, 39636 (2018).
- Merrick, D., et al. Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue. Science. 364, 2501 (2019).
- Schwalie, P. C., et al. A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots. Nature. 559, 103-108 (2018).
- Raajendiran, A., et al. Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues. Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).
- De Matteis, R., et al. In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells. Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).
- Hanamsagar, R., et al. An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples. Scientific Reports. 10, 2219 (2020).
- Marinovic, M. P., et al. Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice. Scientific Reports. 8, 5057 (2018).
- Takahashi, H., et al. Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair. Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).
- Cowan, C. M., et al. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).
- Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).
