Presentiamo un metodo semplice per isolare le cellule progenitrici adipose altamente vitali dalle pastiglie di grasso epididimale del topo utilizzando lo smistamento delle cellule attivato a fluorescenza.
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Articolo metodologico
Preparazione di cellule progenitrici adipose dai tessuti adiposi epididimali del topo
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'obesità e i disturbi metabolici come diabete, malattie cardiache e cancro sono tutti associati a un drammatico rimodellamento dei tessuti adiposi. Le cellule progenitrici adipose residenti nei tessuti (APC) svolgono un ruolo chiave nell'omeostasi dei tessuti adiposi e possono contribuire alla patologia tissutale. L'uso crescente di tecnologie di analisi a singola cellula , tra cui il sequenziamento dell'RNA a singola cellula e la proteomica a singola cellula, sta trasformando il campo delle cellule staminali / progenitrici consentendo una risoluzione senza precedenti dei cambiamenti di espressione delle singole cellule nel contesto dei cambiamenti a livello di popolazione o tessuto. In questo articolo, forniamo protocolli dettagliati per sezionare il tessuto adiposo epididimale del topo, isolare le singole cellule derivate dai tessuti adiposi ed eseguire lo smistamento delle cellule attivate a fluorescenza (FACS) per arricchire per uno Sca1+/ CD31-/CD45-/Ter119- APC praticabile. Questi protocolli consentiranno agli investigatori di preparare APC di alta qualità adatti per analisi a valle come il sequenziamento dell'RNA a cella singola.
Introduzione
Il tessuto adiposo gioca un ruolo chiave nel metabolismo energetico. L'energia in eccesso viene immagazzinata sotto forma di lipidi e il tessuto adiposo è in grado di espansione o retrazione significativa a seconda dello stato nutrizionale e della domanda energetica. L'espansione del tessuto adiposo può derivare da un aumento delle dimensioni degli adipocite (ipertrofia) e/o da un aumento del numero di adipocite (iperplasia); quest'ultimo processo strettamente regolato dalla proliferazione e differenziazione delle cellule progenitrici adipose1,2. Durante l'obesità, il tessuto adiposo si espande eccessivamente ....
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Protocollo
Tutte le procedure sperimentali sugli animali sono state eseguite sotto l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Mayo Clinic.
1. Preparazione della soluzione
- Preparare la soluzione di collagenasi al 2% (w/v) sciogliendo la collagenasi II 2 g nella soluzione salina bilanciata di Hanks da 100 mL (HBSS). Aliquota 200 μL ciascuno per ogni utilizzo.
- Preparare il mezzo di neutralizzazione mescolando 84 mL F-12 medium, 15 mL di siero di cavallo e 1 mL penicillina/streptomicina.
- Preparare il tampone di citometria a flusso sciogliendo 500 mg di albumina di siero....
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Risultati
In questo esperimento sono stati utilizzati topi FVB maschi di quattro mesi. Dopo l'esclusione di detriti e doppietti utilizzando appezzamenti FSC/SSC, le cellule vitali (DAPI- popolazione) sono state gated, seguite dalla selezione di APC+/FITC- popolazione (Figura 1). I gate DAPI, APC e FITC sono stati disegnati in base al controllo non macchiato. Le strategie di gating sono mostrate nella figura 1.
D.......
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Discussione
Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) sta rapidamente guadagnando trazione come un potente strumento per studiare contemporaneamente diverse popolazioni cellulari a livello di singola cellula. A causa degli elevati costi associati alla preparazione del campione e all'elevato sequenziamento della produttività, è imperativo ottimizzare gli input cellulari (alta vitalità e purezza) per aumentare la probabilità di successo sperimentale. Alcuni protocolli di preparazione cellulare si basano sulla rimozione .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Riconosciamo la Mayo Clinic Microscopy Cell Analysis Core Flow Cytometry Facility per l'assistenza allo smistamento FACS.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provetta per microcentrifuga da 1,7 mL | VWR | 87003-294 | |
| Provetta per coltura da 13 mL | Thermo Fisher Scientific | 50-809-216 | |
| Provetta conica da 15 mL | Greiner Bio-one | 188 271 | |
| Provetta da 5 mL con filtro cellulare tappo a scatto | Thermo Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| Provetta conica da 50 mL | Greiner Bio-one | 227 261 | |
| 70 µ filtro cellulare m | Thermo Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Anticorpo anti-CD31-FITC | Miltenyi Biotec | 130-102-519 | |
| Anticorpo anti-CD45-FITC | Miltenyi Biotec | 130-102-491 | |
| Anticorpo anti-Sca1-APC | Miltenyi Biotec | 130-102-833 | |
| Anticorpo anti-Ter119-FITC | Miltenyi Biotec | 130-112-908 | |
| BSA | Gold Biotechnology | A-420-500 | |
| Collagenasi di tipo II | Thermo Fisher Scientific | 17101-015 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| F-12 media | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | |
| Reagente bloccante FcR | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Siero di cavallo | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | |
| Penicillina-streptomicina | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Soluzione di ioduro di propidio | Miltenyi Biotec | Codice 130-093-233 |
Riferimenti
- Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution. The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).
- Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A.
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Ristampe e permessi
