Préparation des cellules progénitrices adipeuses à partir de tissus adipeux épididymaux de souris
Summary
Nous présentons une méthode simple pour isoler les cellules progénitrices adipeuses hautement viables des tampons graisseux épididymaux de souris utilisant le tri cellulaire activé par fluorescence.
Abstract
L’obésité et les désordres métaboliques tels que le diabète, la maladie cardiaque, et le cancer, sont tous associés au remodelage adipeux dramatique de tissu. Les cellules progénitrices adipeuses résidentes des tissus jouent un rôle clé dans l’homéostasie des tissus adipeux et peuvent contribuer à la pathologie tissulaire. L’utilisation croissante de technologies d’analyse à cellules individuelles – y compris le séquençage de l’ARN unicell cellules et la protéomique à cellules individuelles – transforme le champ des cellules souches/progénitrices en permettant une résolution sans précédent des changements d’expression cellulaire individuelle dans le contexte des changements à l’échelle de la population ou des tissus. Dans cet article, nous fournissons des protocoles détaillés pour disséquer le tissu adipeux épididymal de souris, isoler les cellules dérivées de tissus adipeux simples, et effectuer le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour enrichir pour viable Sca1+/CD31–/CD45–/Ter119– APC. Ces protocoles permettront aux chercheurs de préparer des APC de haute qualité adaptés aux analyses en aval, comme le séquençage de l’ARN à cellule unique.
Introduction
Le tissu adipeux joue un rôle clé dans le métabolisme énergétique. L’excès d’énergie est stocké sous forme de lipides, et le tissu adipeux est capable d’expansion ou de rétractation significative en fonction de l’état nutritionnel et de la demande énergétique. L’expansion du tissu adipeux peut résulter d’une augmentation de la taille des adipocytes (hypertrophie) et/ou d’une augmentation du nombre d’adipocytes (hyperplasie); ce dernier processus étroitement régulé par la prolifération et la différenciation des cellules progénitrices adipeuses1,2. Pendant l’obésité, le tissu adipeux se dilate excessivement, et le dysfonctionnement de tissu – y compris l’hypoxie, l’inflammation, et la résistance à l’insuline –développe souvent 3,4. Ces complications sont des facteurs de risque de nombreuses maladies chroniques, y compris l’hypertension, le diabète, les maladies cardiovasculaires, les accidents vasculaires cérébraux et le cancer5. Par conséquent, la limitation de l’expansion incontrôlée des tissus adipeux et l’atténuation des pathologies tissulaires adipeux sont les principales priorités de recherche biomédicale. Au cours de l’expansion des tissus adipeux, les cellules souches adipeuses résidentes dérivées des tissus prolifèrent et se différencient séquentiellement en préadipocytes (cellules progénitrices engagées) puis en adipocytes matures6. Des études récentes sur le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) montrent que ces populations de cellules progénitrices adipeux (APC) (ASC et préadipocytes) présentent une hétérogénéité moléculaire et fonctionnellesubstantielle 7,8,9,10,11,12. Par exemple, les ASC affichent une capacité de différenciation adpogénique réduite, tout en présentant des capacités de prolifération et d’expansion plus élevées, par rapport aux préadipocytes7. D’autres différences moléculaires sont rapportées au sein des populations de NC et de préadipocytes, bien que la pertinence fonctionnelle de ces différences restepeu claire 7. Ensemble, ces données mettent en évidence la complexité du pool de cellules progénitrices adipeux et soulignent la nécessité de mettre au point et de normaliser des outils pour mieux comprendre et manipuler ces populations cellulaires critiques.
Ce protocole détaille l’isolement des populations de cellules progénitrices épididymales à haute viabilité Sca1+ adipose provenant de tampons graisseux épididymaux de souris qui conviennent aux analyses sensibles en aval, y compris les études à cellules simples (scRNA-séquençage) et la culture cellulaire. L’isolement et la dissociation des garnitures épididymales de graisse ont été exécutéscomme précédemment décrit 7,13 avec de légères modifications qui améliorent la viabilité des APC isolés. En bref, les cellules dissociées des adipeuses épididymales sont tachées d’anticorps contre Sca1, un marqueur pour les ASC et les préadipocytes6,7, et d’autres marqueurs de lignée (Lin) : Ter119 (cellules érythroïdes), CD31 (cellules endothéliales) et CD45 (leucocytes). Viable Sca1+/Ter119–/CD31–/CD45–/DAPI– les cellules sont ensuite triées par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Fait important, ce protocole a été validé par l’isolement et l’analyse réussis des cellules progénitrices viables de Sca1++/Lin– adipeuses rapportées dans une étude récente de séquençage d’ARN unicellulaire qui a identifié des sous-populations fonctionnellement hétérogènes dans les ASCs et les préadipocytes7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le séquençage à ARN à cellules simples (scRNA-seq) gagne rapidement du terrain en tant qu’outil puissant pour étudier simultanément diverses populations cellulaires au niveau d’une seule cellule. En raison des coûts élevés associés à la préparation de l’échantillon et au séquençage à haut débit, il est impératif d’optimiser les intrants cellulaires (grande viabilité et pureté) afin d’augmenter les chances de succès expérimental. Certains protocoles de préparation cellulaire reposent sur l…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous reconnaissons l’installation de cytométrie de flux de base d’analyse cellulaire de microscopie de la Clinique Mayo pour l’aide au tri facs.
Materials
| 1.7 mL microcentrifuge tube | VWR | 87003-294 | |
| 13 mL culture tube | Thermo Fisher Scientific | 50-809-216 | |
| 15 mL conical tube | Greiner Bio-one | 188 271 | |
| 5 mL test tube with cell strainer snap cap | Thermo Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| 50 mL conical tube | Greiner Bio-one | 227 261 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Anti-CD31-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-519 | |
| Anti-CD45-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-491 | |
| Anti-Sca1-APC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-833 | |
| Anti-Ter119-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-112-908 | |
| BSA | Gold Biotechnology | A-420-500 | |
| Collagenase type II | Thermo Fisher Scientific | 17101-015 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | |
| FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Propidium iodide solution | Miltenyi Biotec | 130-093-233 |
Riferimenti
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