마우스 전형 지방 조직에서 지방 전구의 준비
Summary
우리는 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 마우스 전도성 지방 패드에서 매우 실행 가능한 지방 전구 세포를 분리하는 간단한 방법을 제시한다.
Abstract
당뇨병, 심장병 및 암과 같은 비만 및 대사 장애는 모두 극적인 지방 조직 리모델링과 관련이 있습니다. 조직 거주자 지방 선조 세포 (APC)는 조직 항상성에 중요한 역할을하고 조직 병리학에 기여할 수 있습니다. 단세포 RNA-염기서열 분석 및 단세포 프로테오믹스를 포함한 단일 세포 분석 기술의 사용이 증가하고 있으며, 인구 또는 조직 전반의 변화의 맥락 내에서 개별 세포 발현 변화의 전례 없는 해결을 허용함으로써 줄기/전구 세포 분야를 변화시키고 있다. 이 문서에서는 마우스 부피 지방 조직을 해부하고, 단일 지방 조직 유래 세포를 분리하고, 형광 활성화 세포 정렬(FACS)을 수행하여 실행 가능한 Sca1 +/CD31–/CD45–/Ter119– APC에 대한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이러한 프로토콜을 통해 조사관은 단일 세포 RNA 염기서열분석과 같은 다운스트림 분석에 적합한 고품질 APC를 준비할 수 있습니다.
Introduction
지방 조직은 에너지 대사에 중요한 역할을합니다. 과도한 에너지는 지질의 형태로 저장되며, 지방 조직은 영양 상태와 에너지 수요에 따라 상당한 확장 또는 후퇴가 가능합니다. 지방 조직의 확장은 지방 세포 크기 (비대) 및 /또는 지방 세포 수 (hyperhyperasia)의 증가에서 발생할 수 있습니다. 후자의 과정은 지방 선조 세포의 증식 및 분화에 의해 단단히조절된다 1,2. 비만 도중, 지방 조직은 과도하게 확장되고, 조직 기능 장애 – 저산소증을 포함하여, 염증 및 인슐린 저항 – 수시로3,4를개발합니다. 이러한 합병증은 고혈압, 당뇨병, 심혈관 질환, 뇌졸중 및 암5를포함한 많은 만성 질환에 대한 위험 요소입니다. 따라서 통제되지 않는 지방 조직 확장을 제한하고 지방 조직 병리학을 완화하는 것이 최고의 생체 의학 연구 우선 순위입니다. 지방 조직 팽창 동안, 상주 지방 조직 유래 줄기 세포 (ASC)는 증식하고 preadipocytes로 순차적으로 분화 (헌신적 인 전구 세포) 다음 성숙한 지방 세포6로분화한다. 최근 단세포 RNA-시퀀싱(scRNA-seq) 연구는 이러한 지방 선조 세포(APC) 집단(ASC 및 preadipocytes)이 상당한 분자 및 기능성 이질성7,8,9,10,11,12를나타낸다는것을 보여준다. 예를 들어, ASC는 감소된 사이포겐화 분화 능력을 표시하는 동시에, 또한 지방세포7에비해 더 높은 증식 및 확장 기능을 나타낸다. 추가 분자 다름은 ASC 및 preadipocyte 인구 내에서 보고됩니다, 그러나 이 다름의 기능적인 관련성은 불분명남아7. 함께, 이러한 데이터는 지방 선조 세포 풀의 복잡성을 강조하고 더 나은 이해하고 이러한 중요한 세포 인구를 조작하기 위해 도구를 개발하고 표준화 할 필요성을 강조한다.
이 프로토콜은 단일 세포 연구 (scRNA-시퀀싱) 및 세포 배양을 포함하여 민감한 다운스트림 분석에 적합한 마우스 상피 지방 패드에서 높은 생존성 Sca1+ 지방 전구 집단의 분리를 자세히 설명합니다. 상고체 지방 패드의 격리 및 해리는 이전에 설명된 바와 같이 수행되었다7,13 격리 된 APC의 생존가능성을 개선하는 약간의 수정. 간단히 말해서, 상고성 지방 패드에서 해리된 세포는 Sca1에 대한 항체, ASC 및 프리디포사이클6,7및기타 계보(Lin) 마커모두에 대한 마커로 염색됩니다: Ter119(적혈구), CD31(내피 세포), CD45(leukocytes). 실행 가능한 Sca1+/ter119–/CD31–/CD45–/DAPI– 세포는 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)에 의해 정렬됩니다. 중요한 것은, 이 프로토콜은 ASC 및 프레디포세포7내의 기능적으로 이질적인 하위 집단을 확인한 최근 단세포 RNA 시퀀싱 연구에서 보고된 실행 가능한 Sca1 +/Lin-분면 전구 세포의 성공적인 격리 및 분석에 의해 검증되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
단세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)은 단일 세포 수준에서 다양한 세포 집단을 동시에 연구하는 강력한 도구로서 빠르게 견인력을 얻고 있다. 시료 준비와 높은 처리량 시퀀싱과 관련된 높은 비용으로 인해 실험 성공 가능성을 높이기 위해 세포 입력(높은 생존가능성 및 순도)을 최적화하는 것이 필수적입니다. 일부 세포 준비 프로토콜은 FACS 정렬14없이 낮은 스핀 세차및 컬럼 기반 분리?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 FACS 분류에 대한 지원을 위해 메이요 클리닉 현미경 세포 분석 코어 흐름 세포 분석 시설을 인정합니다.
Materials
| 1.7 mL microcentrifuge tube | VWR | 87003-294 | |
| 13 mL culture tube | Thermo Fisher Scientific | 50-809-216 | |
| 15 mL conical tube | Greiner Bio-one | 188 271 | |
| 5 mL test tube with cell strainer snap cap | Thermo Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| 50 mL conical tube | Greiner Bio-one | 227 261 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Anti-CD31-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-519 | |
| Anti-CD45-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-491 | |
| Anti-Sca1-APC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-833 | |
| Anti-Ter119-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-112-908 | |
| BSA | Gold Biotechnology | A-420-500 | |
| Collagenase type II | Thermo Fisher Scientific | 17101-015 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | |
| FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Propidium iodide solution | Miltenyi Biotec | 130-093-233 |
Riferimenti
- Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution. The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).
- Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).
- Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).
- Halberg, N., et al. Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue. Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).
- Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C. Obesity as a Disease. Medical Clinics of North America. 102, 13-33 (2018).
- Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future. Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).
- Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling. Life Science Alliance. 2, 201900561 (2019).
- Burl, R. B., et al. Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling. Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).
- Hepler, C., et al. Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice. eLife. 7, 39636 (2018).
- Merrick, D., et al. Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue. Science. 364, 2501 (2019).
- Schwalie, P. C., et al. A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots. Nature. 559, 103-108 (2018).
- Raajendiran, A., et al. Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues. Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).
- De Matteis, R., et al. In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells. Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).
- Hanamsagar, R., et al. An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples. Scientific Reports. 10, 2219 (2020).
- Marinovic, M. P., et al. Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice. Scientific Reports. 8, 5057 (2018).
- Takahashi, H., et al. Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair. Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).
- Cowan, C. M., et al. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).
- Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).
