Preparação de células progenitoras adiposas adiposas de tecidos adiposos epidímicos do rato
Summary
Apresentamos um método simples para isolar células progenitoras adiposas altamente viáveis de almofadas de gordura epidímica do rato usando a triagem celular ativada por fluorescência.
Abstract
Obesidade e distúrbios metabólicos, como diabetes, doenças cardíacas e câncer, estão todos associados à dramática remodelação do tecido adiposo. As células progenitoras adiposas residentes em tecido (APCs) desempenham um papel fundamental na homeostase tecidual e podem contribuir para a patologia do tecido. O uso crescente de tecnologias de análise celular única – incluindo sequenciamento de RNA unicelular e proteômica unicelular – está transformando o campo de células-tronco/progenitora, permitindo uma resolução sem precedentes de mudanças individuais de expressão celular no contexto de mudanças populacionais ou teciduais. Neste artigo, fornecemos protocolos detalhados para dissecar tecido adiposo epidímico do camundongo, isolar células derivadas de tecido adiposo único e realizar a triagem celular ativada de fluorescência (FACS) para enriquecer para Sca1+/CD31 viável–/CD45–/Ter119– APCs. Esses protocolos permitirão que os pesquisadores preparem APCs de alta qualidade adequados para análises a jusante, como sequenciamento de RNA de célula única.
Introduction
O tecido adiposo desempenha um papel fundamental no metabolismo energético. O excesso de energia é armazenado na forma de lipídios, e o tecido adiposo é capaz de expansão ou retração significativa, dependendo do estado nutricional e da demanda energética. A expansão do tecido adiposo pode resultar de um aumento no tamanho do adipócito (hipertrofia) e/ou de um aumento no número de adipócitos (hiperplasia); este último processo fortemente regulado pela proliferação e diferenciação das células progenitorasadiposas 1,2. Durante a obesidade, o tecido adiposo se expande excessivamente, e a disfunção tecidual – incluindo hipóxia, inflamação e resistência à insulina – muitas vezes desenvolve3,4. Essas complicações são fatores de risco para muitas doenças crônicas, incluindo hipertensão arterial, diabetes, doenças cardiovasculares, acidente vascular cerebral e câncer5. Assim, limitar a expansão descontrolada do tecido adiposo e mitigar as patologias do tecido adiposo são prioridades de pesquisa biomédica. Durante a expansão do tecido adiposo, as células-tronco derivadas do tecido adiposo residente (ASCs) proliferam e diferenciam-se sequencialmente em pré-adipócitos (células progenitoras comprometidas) e, em seguida, em adipócitos maduros6. Estudos recentes de sequenciamento de RNA unicelular (scRNA-seq) mostram que essas populações de células progenitoras adiposas (APC) (ASCs e preadipócitos) apresentam heterogeneidade molecular e funcional substancial7,8,9,10,11,12. Por exemplo, as ASCs apresentam uma capacidade de diferenciação adipogênica reduzida, ao mesmo tempo em que apresentam maiores capacidades de proliferação e expansão, em comparação com os pré-apócitos7. Outras diferenças moleculares são relatadas nas populações asc e pré-doença, embora a relevância funcional dessas diferenças ainda não esteja clara7. Juntos, esses dados destacam a complexidade do pool de células progenitoras adiposas e ressaltam a necessidade de desenvolver e padronizar ferramentas para melhor entender e manipular essas populações celulares críticas.
Este protocolo detalha o isolamento de populações de células progenitoras de alta viabilidade Sca1+ adiposas de blocos de gordura epidídica de camundongos que são adequados para análises sensíveis a jusante, incluindo estudos unicelulares (scRNA-sequenciamento) e cultura celular. O isolamento e dissociação de almofadas de gordura epidídica foi realizado como descrito anteriormente7,13 com pequenas modificações que melhoram a viabilidade de APCs isolados. Em suma, células dissociadas de almofadas de gordura epidídimo são manchadas com anticorpos contra Sca1, um marcador para ambos os ASCs e preadipócitos6,7, e outros marcadores de linhagem (Lin): Ter119 (células eritróides), CD31 (células endoteliais) e CD45 (leucócitos). As células Viável Sca1+/Ter119–/CD31–/CD45–/DAPI– são então classificadas por fluorescência ativada de classificação celular (FACS). É importante ressaltar que este protocolo foi validado pelo isolamento e análise bem-sucedidos de células progenitoras viáveis Sca1+/Lin– adiposas relatadas em um estudo recente de sequenciamento de RNA de célula única que identificou subpopulações funcionalmente heterogêneas dentro de ASCs e preadipócitos7.
Protocol
Representative Results
Discussion
O sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) está rapidamente ganhando tração como uma ferramenta poderosa para estudar simultaneamente diversas populações celulares no nível único celular. Devido aos altos custos associados à preparação da amostra e ao sequenciamento de alto rendimento, é imperativo otimizar as entradas celulares (alta viabilidade e pureza) para aumentar a probabilidade de sucesso experimental. Alguns protocolos de preparação celular dependem da remoção de células mortas e detri…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconhecemos a Instalação de Citometria do Núcleo de Análise celular da Clínica Mayo clinic para assistência com a triagem FACS.
Materials
| 1.7 mL microcentrifuge tube | VWR | 87003-294 | |
| 13 mL culture tube | Thermo Fisher Scientific | 50-809-216 | |
| 15 mL conical tube | Greiner Bio-one | 188 271 | |
| 5 mL test tube with cell strainer snap cap | Thermo Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| 50 mL conical tube | Greiner Bio-one | 227 261 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Anti-CD31-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-519 | |
| Anti-CD45-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-491 | |
| Anti-Sca1-APC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-833 | |
| Anti-Ter119-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-112-908 | |
| BSA | Gold Biotechnology | A-420-500 | |
| Collagenase type II | Thermo Fisher Scientific | 17101-015 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | |
| FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Propidium iodide solution | Miltenyi Biotec | 130-093-233 |
Riferimenti
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