Summary
在这里，我们描述了一个简单的方法，结合RNA荧光原位杂交（RNA-FISH）与免疫荧光可视化严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（SARS-CoV-2）RNA。该协议可以增加对SARS-CoV-2 RNA-主机在单细胞水平上的分子特征的理解。
Abstract
本手稿提供了原位杂交链反应 （HCR） 与免疫荧光的协议，可直观地将严重急性呼吸系统综合征冠状病毒 2 （SARS-CoV-2） RNA 在细胞系中和人类气道上皮的三维 （3D） 培养物中。该方法允许高度具体和敏感的病毒RNA可视化，依靠HCR启动的探针本地化。拆分启动器探头通过荧光标记的放大器帮助放大信号，导致共焦显微镜中可忽略不计的背景荧光。用不同的荧光染料标记放大器有助于同时识别各种目标。这反过来又使组织中的感染图谱能够更好地了解单细胞水平的病毒发病机能和复制。将这种方法与免疫荧光相结合，可以促进更好地了解宿主-病毒相互作用，包括宿主表观基因组和免疫反应通路的交替。由于敏感和特定的HCR技术，此协议也可以用作诊断工具。同样重要的是要记住，该技术可能很容易修改，以便能够检测任何RNA，包括将来可能出现的非编码RNA和RNA病毒。
Introduction
SARS-CoV-2是一种新型的人类β可罗纳病毒，于2019年底出现，几个月后引发了前所未有的大流行。由于该病毒是科学的新生病毒，因此其大部分生物学及其对宿主细胞的影响仍不得而知。因此，如果要了解病毒细胞和组织在感染过程中的三胞头，其基本的生物学特征及其对宿主的影响就很重要。使用多种技术来检查病毒宿主之间的相互作用，包括生化、生物和物理检测。原位杂交是一种常用方法，它采用标记的互补DNA、RNA或改性核酸探针，该探针定位到细胞或组织中的特定DNA或RNA序列。
一种新的RNA荧光原位杂交（RNA-FISH）方法已经开发出来，它结合了修改，通过HCR1放大信号与噪声比来增加灵敏度。HCR 允许在单细胞级别上研究 RNA 本地化。由于其特异性、灵敏度和分辨率高，这种方法不仅对基础科学研究有用，而且对应用项目（如诊断）也很有用。最近，该方法的可行性被证明用于检测SARS-CoV-2RNA本地化为完全分化的3D人类气道上皮（HAE）培养物2中的附属细胞。HAE文化是用于研究"自然感染"微环境3、4背景下病毒感染的最先进工具之一。
包括SARS-CoV-2在内的几份关于人类冠状病毒（HCoV）的报告强调了表观遗传学对HCoV感染和病理生理学（在5中回顾）的重要性，例如编码血管紧张素转换酶2（ACE-2）受体6、7的基因的甲基化模式。有趣的是，质谱筛查发现了几个与SARS-CoV-2蛋白体8相互作用的表观遗传因素。更具体地说，非结构蛋白 5 （NSP5） 与表观遗传调节器、高石脱乙酰酶 2 结合，催化不活跃 NSP5 （C145A） 与 tRNA 甲基转移酶 1 （24） 相互作用。此外，NSP16甲基转移酶活性被甲基转移酶抑制剂西内芬金9阻断。然而，这些表观遗传因素在COVID-19中的确切作用尚不清楚。HCoV的复制发生在受感染细胞的细胞质中，并触发由表观遗传修饰调节的炎症反应10。
例如，HCoV-229E微调核因子-卡帕B信号，并通过在某些区域增加H3K36和H4K5的乙酰化，对宿主细胞色度图进行深刻重新编程。中东呼吸系统综合症相关冠状病毒感染增加了H3K27me3的水平，并耗尽了H3K4me3在特定干扰素敏感基因12子集的促进区域。此外，病毒RNA触发细胞免疫反应，如病毒13，逆转录病毒14，15和冠状病毒16证明。病毒RNA上的表观遗传标记可能起到细胞传感器识别的作用，如人类免疫缺陷病毒-1 RNA17的m7A甲基化所示。然而，问题依然存在：SARS-CoV-2RNA对免疫反应有何影响，是否涉及表观遗传标记？
在这里，介绍了一种优化的RNA-FISH方法，以及细胞系和3D组织（完全分化HAE）的免疫荧光分析。虽然细胞学方法，如FISH和免疫荧光，被广泛使用，这种基于HCR的新一代原位杂交方法从未用于病毒检测（除了在最近的出版物）2。一般来说，免疫染色和鱼氧化物需要以下步骤：渗透，使探针或抗体穿透：固定其中细胞材料固定和保存;检测其中应用抗体或核酸探针;最后，安装样品进行可视化。
虽然现有协议具有这些通用功能，但它们在所涉及的参数方面存在显著差异。在这里，一个优化的，简单的，免疫-RNA-FISH协议已经描述检测SARS-CoV-2RNA在HAE培养和维罗细胞。该技术包括以下步骤：（1） 用甲醛固定细胞：（2） 用洗涤剂或甲醇（MeOH） 渗透：（3） 通过一系列分级的 MeOH 解决方案（仅限 HAE 文化）进行补液：（4） 检测：（五）利用HCR技术检测SARS-CoV-2RNA的放大：（六）免疫学：和（7）在共焦显微镜下成像。
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Protocol
1. 缓冲区准备
- 对于 500 mL 的 2 倍 PHEM 缓冲器，将 18.14 克管道拉辛 -N，N+-二（2-乙烷硫酸）（PIPES），6.5 克 4-（2-羟基苯甲酸） 1-管道丙烷硫酸（HEPES）、3.8克乙二醇四乙酸（EGTA）和0.99克硫酸镁（MgSO4）。用蒸馏水（dH2O）使体积达到~400毫升，搅拌，然后使用10M氢氧化钾（KOH）或氢氧化钠（NAOH）将pH调整到7.0。使最终音量达到 500 mL，然后拆分为 50 mL 的别名。储存在-20°C，直到需要。
注：缓冲区在 pH 达到 7.0 之前不会清晰。 - 准备 37% 的库存溶液，其中不含甲醛 （PFA）。对于 50 毫升，将 18.5 克 PFA 和 35 毫升 dH2O 混合在玻璃瓶中。将瓶子放在带加热的磁性搅拌器上。加入 900 μL 的 1 M KOH 或 NaOH，搅拌，直到解决方案变得清晰。允许冷却并转移到50mL圆锥离心机管：充值至50毫升与dH2O。解决方案可存储在 -20 °C，直到需要为止。
注意：甲醛应在戴防护手套和实验室外套时用烟熏罩处理。 - 准备固定缓冲区（3.7%PFA缓冲与PHEM）。对于 50 mL，在 50 mL 锥形离心机管中组合 5 mL 的 37% PFA 解决方案、25 mL 的 2 倍 PHEM 缓冲器和 20 毫升 dH2O。储存在-20°C，直到需要。
注意：解冻后，缓冲区可存储在 4 °C 以至 3 个月之久。 - 准备PBST（0.1%补间-20在1x磷酸盐缓冲盐水[PBS]）。对于 50 mL，添加 50 μL 的 100% 补间-20 至 50 mL 的 1x PBS，并很好地混合。
注：解决方案可在室温下存储 （RT）。 - 通过将 MeOH/PBST 组合在 3：1、1：1 和 1：3 的比例（每份最终体积为 100 mL;参见 表 1）来准备补液缓冲器。
注意：MEOH是非常有毒和易燃的。因为它可以损害视神经，它应该在烟雾罩处理，避免任何明火。由于混合MeOH和PBST会产生外热反应，因此将冰上的溶液组合在一起。 - 对于 1000 毫升的 20x SSC，将 175.3 克氯化钠 （NaCl） 和 88.2 克柠檬酸钠混合在烧瓶中，并加满 800 毫升的 dH2O. 搅拌至溶解，并使用 NaOH 将 pH 调整为 7.2。将 dH2O 添加到总体积为 1000 mL 中，然后通过 0.22 μm 滤镜将高压灭菌器或滤芯过滤到自封瓶中。
- 对于 50 毫升的 5 倍 SSCT，将 20 倍 SSC 缓冲区的 12.5 mL 与 37.5 mL 的 dH2O 组合在一起，并添加 50 μL 的 100% Tween-20。混合好。
- 对于 50 mL 的 50% 5x SSCT/50% PBST，将 25 mL 的 5 倍 SSCT 与 25 mL 的 PBST 组合在一起。
- 对于 2x SSC 的 50 毫升，将 5 毫升的 10 倍 SSC 缓冲区与 45 毫升的 dH2O. 混合好。
注意：所有SSC缓冲区应存储在黑暗中的RT。
2. 目标定义、探头和放大器
- 使用制造商网站上可用的工具来设计放大器和探头。确保探针与SARS-CoV-2 N基因的反向DNA链（补充图1）相辅相成。
- 确定最佳探头集大小（一组 20 个探头足以可视化）。
- 设置用于目标RNA检测的放大器。
- 使用标有亚历克萨氟647的HCR放大器B1。
注：HCR 放大器包括可转移的 HCR 发夹 h1 和 h2。使用此协议可以设计多路复用实验。如果计划这样做，请选择不同的HCR放大器（B1，B2，...），以便在同一样本中对每个目标RNA进行成像（例如，目标1的放大器B1，目标2的放大器B2，...）。
- 使用标有亚历克萨氟647的HCR放大器B1。
3. 细胞培养和感染SARS-CoV-2
- 培养维罗（猴子肾上皮细胞）细胞在杜尔贝科的修改鹰介质含有5%的胎儿牛血清。
- 种子 50，000 细胞到盖片 （No. 1， 15 × 15 毫米） 在 12 井板.
- 在透气跨井插入支架上用 膜（直径 = 6.5 mm） 和支气管上皮生长介质培养培养物，以备不时之用。
- 病毒感染
- 接种SARS-CoV-2的细胞，每mL组织培养中位数感染剂量（TCID50）
- 在37°C下孵化细胞2小时。
- 用 PBS 清洗两次细胞以去除未绑定病毒。
- 培养细胞为48小时。
4. 在盖片培养的维罗细胞中的 SARS-CoV-2 RNA-FISH
第 1 天
- 修复和渗透细胞
- 在 RT 使用 3.7% 的 w/v PFA 解决方案修复受感染的细胞，使用 1 小时。
- 吸气 3.7% PFA 溶液，使用 1 倍 PBS 洗涤细胞两次。
- 在 RT 中用 PBST 溶液使细胞渗透 10 分钟，并激动地进行。
- 吸气PBST，用1倍PBS洗两次细胞。
- 检波
- 吸气1倍PBS溶液，并在RT用2x SSC洗两次细胞。
- 吸气 2x SSC 溶液，并通过添加至少 300 μL 的探针杂交缓冲来预混合样品。盖住含有细胞的井，在37°C孵育30分钟。
- 通过在探头混合缓冲区中加入 1.2 pmol 的探针混合物来准备探针解决方案。
- 使用 1 μM 探头库存的 1.2 μL 来准备 300 μL 的工作库存。
- 取出预贿赂溶液，并将盖片转移到加湿室。
- 将探针溶液的 30-50μL 吹到胶片上，形成单个液滴。
- 在 37 °C 处过夜（12-18 h） 孵化样品。
第2天 - 将盖片重新转移到 12 井板中，并在 37 °C 下用 400 μL 的探头清洗缓冲器清洗 4 x 5 分钟，去除多余的探头溶液。
注意：作为将 30-50μl 别名放在底片上和覆盖膜下进行孵化的替代方案，请直接添加 300 μL 的探针溶液，以覆盖 12 井板中的盖片。此过程更简单，但需要大量的试剂。使用前将探头洗涤缓冲器加热至 37 °C。计算所需的缓冲区量，并将其转移到 15 mL 锥形离心机管中。 - 在RT使用5x SSCT清洗样品2 x 5分钟。
- 将 5 倍 SSCT 解决方案替换为 1 倍 PBS，并将样品存储在 4 °C，直到放大。
- 放大
- 从井中取出 1 倍 PBS 溶液，并在每个井中加入至少 300 μL 的放大缓冲。在 RT 孵化样品 30 分钟。
- 通过在单独的管中快速冷却所需的体积来准备每个HCR发夹（h1和h2）。
- 要准备 300 μL 的放大溶液，请使用每个发夹的 18 pmol（例如，对于 300 μL，使用 3 μM 库存发夹溶液的 6 μL）。
- 将发夹溶液转移到管中。
- 在95°C孵育90年代。
- 在黑暗中冷却到RT30分钟。
- 通过在放大缓冲区中添加快速冷却的"h1"和"h2"发夹来准备发夹混合物。
- 将30-50μL的发夹混合物滴入胶片上。
- 在 RT 的黑暗中在夜间 （12-18 h） 孵化样品。
第3天 - 将盖片移回 12 个井板，并通过在 RT 中搅拌 5 x 5 分钟，用 5 倍 SSCT 去除多余的发夹。
- 吸气 5 倍 SSCT 缓冲区，代之以 1 倍 PBS 。
注意：如有必要，请在标准免疫荧光检测中使用RNA-FISH样本，然后对核进行染色（见第5节）。
- 核染色和滑动安装
- 吸气 1x PBS 解决方案，并在 1x PBS 解决方案中将其替换为 4+，6-二恶英-2-苯林多（DAPI，0.2μg/mL）。
- 在黑暗中在RT孵化样品10分钟。
- 吸气 DAPI 溶液，用 1 倍 PBS 洗两次细胞。
- 放置两滴10μL的安装介质：确保将滴子充分分离，以便将两个盖片放置在单个幻灯片上。
- 通过敲击干净毛巾上的盖子，去除多余的液体，然后将它们置于反法德安装介质中，细胞朝下。
- 将安装的样品放在干燥平坦的黑暗表面，让它们进行固化。
- 固化后，用 VALAP 密封剂或指甲油密封盖片的边缘，以防止样品干燥。
5. HAE 文化中的 SARS-CoV-2 RNA-鱼
第 1 天
- 修复和渗透 HAE 文化
- 吸气介质，并在RT使用3.7%PFA溶液修复受感染的细胞1小时。
- 吸气 3.7% PFA 溶液，用 1 倍 PBS 洗两次细胞。
- 在跨井插入下，用 1 倍 PBS 替换 3.7% 的 PFA 解决方案。
- 丢弃 PBS，然后使用 2 x 5 分钟洗涤器使样品脱水，100% MeOH 预制为 -20 °C。
- 第二次洗涤后，用新鲜的冷MeOH代替缓冲区，在Transwell插入下渗透。在-20°C过夜。
第2天
- 再水化
通过冰上分级的 MeOH/PBST 解决方案系列（每组 5 分钟）补充样品水分：75% MeOH/25% PBST、50% MeOH/50% PBST、25% MEOH/75% PBTS 和 100% PBST（两次）。- 在冰上用 50% 5 倍 SSCT/50% PBST 清洗细胞 5 分钟。
- 用5倍SSCT在冰上清洗细胞5分钟。
- 用 1 倍 PBS 替换 5 倍 SSCT 缓冲区。
- 检波
- 在冰上用100μL的探针杂交缓冲器孵化细胞（在Transwell插入器内）5分钟。接下来，在37°C（预灌木化）下将盘子转移到孵化器30分钟。
注意：探头混合缓冲区在使用前必须预热至 37 °C。计算所需的音量：单个跨井插入需要 100 μL。 - 准备探头解决方案。由于 1 mL 的探头解决方案需要 4 pmol 的探针，因此在 1 mL 的探针杂交缓冲区中加入 1 μL 的 1 μM 探头库存解决方案，并很好地混合。
注意：对于RNA检测，请使用每个跨井插入100μL的探针溶液。将探针溶液留在冰上，直到预贿赂步骤结束。 - 删除预贿赂解决方案，并添加探头解决方案。
- 在 37 °C 处隔夜（12-18 h） 孵化细胞。
第3天 - 通过在 37 °C 下使用 100 μL 的探头清洗缓冲器清洗 4 x 15 分钟来去除多余的探头。
- 在RT使用5x SSCT清洗样品2 x 5分钟。
- 将 5 倍 SSCT 替换为 1 倍 PBS，并将样品存储在 4 °C，直到放大。
- 在冰上用100μL的探针杂交缓冲器孵化细胞（在Transwell插入器内）5分钟。接下来，在37°C（预灌木化）下将盘子转移到孵化器30分钟。
- 放大
- 通过在 RT 上用放大缓冲器孵化样品 30 分钟来预加样品。
- 通过在单独的管中快速冷却所需的体积来准备每个发夹。
- 要准备 500 μL 的放大溶液，请使用每个发夹的 30 pmol（例如，对于 500 μL，使用 10 μL 的 3 μM 库存发夹溶液）。
- 将发夹溶液转移到管子上。
- 在95°C孵育90年代。
- 在黑暗中冷却到RT30分钟。
- 通过在 RT 将所有扣冷发夹添加到 500 μL 的放大缓冲器中，准备发夹解决方案。
- 删除预加放大解决方案，并添加完整的发夹解决方案。
- 在黑暗中在 RT 过夜 （12-18 h） 孵化样品。
- 通过在 RT 中用 5 倍 SSCT 清洗去除多余的发夹，具体如下： 2 x 5 分钟、2 x 15 分钟和 1 x 5 分钟。
- 将 5 倍 SSCT 解决方案替换为 1 倍 PBS，并在 4 °C 中存储不超过 2-3 天，或直接进行核染色。
注意：如有必要，请在标准免疫荧光检测中使用RNA-FISH样本，然后进行核染色（见第6节）。
- 核染色和滑动安装
- 吸气 1x PBS 解决方案，并在 1x PBS 中将其替换为 DAPI 解决方案 （0.2μg/mL）。
- 在黑暗中在RT孵化样品10分钟。
- 吸气 DAPI 溶液，用 1 倍 PBS 洗两次细胞。
- 将 Transwell 插入的切口膜放置在 10 μL 的抗法德安装介质上，将细胞朝上，并在膜上添加额外的安装介质 （5 μL）。
- 用盖子盖住膜。
- 在黑暗中将安装的样品涂在干燥平坦的表面上。
- 固化后，用 VALAP 密封剂或指甲油密封盖片的边缘，以防止样品干燥。
6. 维罗细胞和HAE培养物的免疫荧光分析
注意：在第3天对细胞系进行免疫荧光检测，或对HAE培养物进行第4天免疫荧光检测。对每个模型使用不同的方法。所有差异都清楚表明。
- 从井中吸气 1 倍 PBS 解决方案。
- 在 PBST 溶液中用 1% w/v 牛血清白蛋白在 37 °C 下孵化 30 分钟来阻止样品。
- 通过在阻断溶液中准备适当的稀释并孵育，准备主要抗体。
- 对于盖片上的维罗细胞：
- 将30-50μL的抗体溶液滴入湿度室的胶片上。
- 将盖子盖在抗体滴上，细胞朝下。
- 对于 HAE，用抗体溶液 （100 μL） 替换插入物中的阻塞剂，并将样品孵化在加湿室中。
注意：用原抗体调整每次孵化的时间和温度。典型的参数是2小时在RT或过夜在4°C。
- 对于盖片上的维罗细胞：
- 使用PBST清洗样品3 x 5分钟。
- 对于盖片上的细胞，转移到12井板，并添加PBST解决方案。
- 对于 HAE 文化，用 PBST 解决方案替换抗体解决方案。
- 检查可用于对焦显微镜的光源和过滤器。
- 根据宿主物种选择次生抗体。根据可用光源选择荧光参数（激发和发射波长、光谱宽度和激发效率）。
注：光谱参数可以使用在线工具进行建模（参见 材料表）。 - 通过用阻塞溶液稀释适当的二次抗体解决方案，准备适当的二次抗体解决方案。
- 用二次抗体孵育（如在6.3），但在37°C孵育1小时。
- 将样品按步骤 6.4 清洗。
- 核染色和滑动安装
- 用于盖片上的单元格
- 吸气PBST，并在1x PBS解决方案中将其替换为DAPI（0.2微克/mL）。
- 在黑暗中在RT孵化样品10分钟。
- 吸气 DAPI 溶液，用 1 倍 PBS 洗两次细胞。
- 将盖片放在 10 μL 的安装介质滴上，细胞朝下。
- 用指甲油密封盖子。
- 对于HAE文化
- 吸气1倍PBST，并在1x PBS溶液中替换为DAPI（0.2μg/mL）。
- 在黑暗中在RT孵化样品10分钟。
- 吸气 DAPI 溶液，用 1 倍 PBS 洗两次细胞。
- 将切出的膜放在 10 μL 的安装介质滴上，将细胞朝上，并在膜上添加额外的 （5 μL） 安装介质。
- 用盖子盖住膜。
- 用指甲油密封盖子。
- 用于盖片上的单元格
7. 聚焦显微镜
- 通过指定使用的氟磷来定义轨道。
- 选择扫描模式和速度。
- 通过将每个氟磷与各自的负控制进行比较来调整每个荧光素的激光功率、增益和偏移值：用于病毒、模拟感染细胞：对于细胞蛋白，样品沾染了来自适当宿主的异型控制抗体。
- 要获取 3D 图像，请激活 z 堆栈模式，并设置顶部和底部限制。设置步数/数字。
注：有关冠状病毒成像的更多详细信息，请参阅19。
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Representative Results
本手稿中描述的免疫-RNA-FISH协议使用两个蜂窝系统执行：维罗细胞系和3D HAE培养物。两个蜂窝模型的主要步骤都显示在 表 2 中。RNA-FISH 在 HAE 培养中可视化 SARS-CoV-2 的协议包括组织样本的典型步骤，即通过一系列 MeOH-PBS 和 0.1% Tween 解决方案，以 100% MeOH 渗透和补液。免疫荧光是在RNA-FISH完成之后进行的。获取和处理了 Zstack 图像。
图1 显示免疫RNA FISH在模拟接种控制维罗细胞或感染SARS-CoV-2的细胞。 图2 显示免疫RNA FISH在模拟接种控制HAE文化或感染SARS-CoV-2的文化。 图3 显示Vero细胞渗透协议的优化：70%乙醇在-20°C或0.1%Tween-20在PBS中5分钟在RT.用洗涤剂渗透导致SARS-CoV-2亚基因组RNA的清晰，特定的信号，而使用乙醇导致一个模糊的无重点图像。
图1：免疫-RNA-FISH检测维罗细胞中的SARS-CoV-2RNA和β-图布林。 在（A）感染和（B）模拟接种的维罗细胞中实现 SARS-CoV-2 亚基因组RNA 的本地化。病毒RNA由鱼（红色）可视化。β-图布林染上抗体对小鼠β5tubulin（1：100，夜间孵育在4°C）和亚历克萨氟磷488共生的二次抗体（1：400，1小时潜伏在RT）。核上沾满了DAPI（蓝色）。每个图像都是一个单一的圆锥平面。比例栏 =20 μm。缩写：SARS-CoV-2 = 严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2;FISH = 原位杂交的荧光;达皮 = 4+， 6 - 迪亚米迪诺 - 2 - 菲尼林多尔。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：感染SARS-CoV-2的人类气道上皮细胞。 在（A）感染和（B）模拟接种的 HAE 文化中，SARS-CoV-2 亚基因组RNA 的本地化。病毒RNA由鱼（红色）可视化。附属细胞使用抗体可视化，对抗小鼠 β5-tubulin （1：100，在 4 °C 的夜间孵育），使用 Alexa 氟磷 488 共生的二次抗体（1：400，RT 1 h 孵化）。核上沾满了DAPI（蓝色）。每个图像表示从对焦图像堆栈（厚度 = 3 μm）重建的最大投影。比例栏 =10 μm。缩写：SARS-CoV-2 = 严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2;FISH = 原位杂交的荧光;HAE=人类气道上皮：达皮 = 4+， 6 - 迪亚米迪诺 - 2 - 菲尼林多尔。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：优化维罗细胞的渗透条件。 维罗细胞的渗透与 （A） 70% 乙醇和 （B） 与 0.1% 补间 - 20 在 PBS.用洗涤剂渗透会导致SARS-CoV-2亚基因组RNA的明确特定信号，而乙醇则会导致图像模糊。病毒RNA以红色显示。核上沾满了DAPI（蓝色）。每个图像表示从对焦图像堆栈（厚度 = 3 μm）重建的最大投影。比例栏 =10 μm。缩写：SARS-CoV-2 = 严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2;PBS = 磷酸盐缓冲盐水;达皮 = 4+， 6 - 迪亚米迪诺 - 2 - 菲尼林多尔。 请单击此处查看此图的较大版本。
补充图1：SARS-CoV-2 N基因序列（5'-3'） 请单击此处下载此文件。
| 缓冲区 | 甲醇体积[mL] | PBST[mL] |
| 75% 美/25% PBST | 75 | 25 |
| 50% 美/50% PBST | 50 | 50 |
| 25% 美/75%PBST | 25 | 75 |
| 100%百万元 | 0 | 100 |
| 总 | 100毫升 | |
表1：准备梯度甲醇/PBST补液解决方案。 为了在绝对甲醇（MeOH）中过夜孵育后补充人体气道上皮样品的水分，有必要缓慢地交换环境。为此，必须通过缓冲器进行缓慢的交换，缓冲器中 MeOH 和 PBST 的比例（0.1% Tween-20 在 1x 磷酸盐缓冲盐水中）逐渐变化。试剂体积足以准备每个解决方案的100mL，足以进行几个实验，列出。
| 模块 | 步 | 维罗细胞 | 海文化 |
| 原位杂交RNA荧光（RNA鱼） | 固定 | （3.7% PFA） 10-40 分钟室温或室温过夜 | |
| 渗透 | （PBST： 0.1% 补间-20 在 1x PBS） 10 分钟室温下 | （0.1% Tween-20 在 1x PBS） 2 × 5 分钟室温下 | |
| （100%MeOH）在-20°C过夜 | |||
| 再水化 | （分级甲醇（MEOH）/PBST） 5 x 5 分钟， 50% 5x SSCT/PBST 洗 5 分钟， 5x SSCT 在冰上洗 5 分钟 | ||
| 检测（杂交前） | （探针杂交缓冲区） 30 分钟，37 °C， 200-300 μL | （探针杂交缓冲区）在冰上5分钟，然后30分钟在37°C，100μL | |
| 检波 | （探针解决方案） 12-18 h 在 37 °C， 30 - 50 μL | （探针解决方案） 12-18 h 在 37 °C， 100 μL | |
| 探针清洗 | （探针洗缓冲区） 4 x 5 分钟 | （探针洗缓冲区） 4 x 15 分钟 | |
| （5 × SSCT） 2 x 5 分钟 | |||
| 放大（预放大） | （放大缓冲区） 室温下 30 分钟，200-300 μL | （放大缓冲） 室温下 30 分钟，100 μL | |
| 放大 | （放大器解决方案） 12-18 h 在室温下在黑暗的地方， 30-50 μL | （放大器解决方案） 12-18 h 在室温下在黑暗的地方， 100 μL | |
| 放大器清洗 | （5x SSCT） 5 x 5 分钟 | （5x SSCT） 2 x 5 分钟， 2 x 15 分钟， 1 x 5 分钟 | |
| 免疫荧光（IF） | 阻塞 | （PBST中的BSA为1%）30分钟，37°C | |
| 初级抗体孵化 | （阻塞溶液中一种用量合适的抗体溶液）室温下2小时/夜间4°C，30-50 μL | （阻塞溶液中指定浓度的抗体溶液）室温下2小时/夜间4°C，100μL | |
| 主要抗体清洗 | （PBST） 3 x 5 分钟室温下 | ||
| 二次抗体孵化 | （阻塞溶液中相关浓度的抗体溶液）1 h 在 37 °C， 30-50 μL | （阻塞溶液中适当浓度的抗体溶液）1 h 在 37 °C， 100 μL | |
| 二次抗体洗涤 | （PBST） 3 x 5 分钟室温下 | ||
| 核染色 | （DAPI 解决方案） 室温下 10 分钟，然后 2 x 5 分钟，带 1 倍 PBS | ||
表2：细胞系和HAE培养物中免疫-RNA-FISH协议的工作流程。 免疫-RNA-FISH在两种细胞模型中都是可行的，但需要不同的方法。主要步骤显示，以及使用的缓冲（括号中），然后是孵化的持续时间和温度。在几个步骤中，为简化计算，每个样本的孵化试剂体积存在严重差异。如果不指定音量，则任意选择该音量，以便它完全覆盖样本（通常为 200 μL）并具有激动性。缩写：FISH = 原位杂交的荧光;HAE=人类气道上皮：PFA=甲醛：达皮 = 4+，6-迪亚米迪诺-2-菲尼林多尔;BSA=牛血清白蛋白;PBS = 磷酸盐缓冲盐水;梅奥=甲醇。
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Discussion
免疫-RNA-FISH是RNA和细胞蛋白双重染色的可靠方法。在这里，描述了一个经过修改的免疫-RNA-FISH协议，允许检测SARS-CoV-2RNA和细胞蛋白的细胞系和HAE培养物。此协议可适用于不同的细胞模型，包括细胞单层或特定组织。该方法依赖于由适当的探头本地化启动的HCR的概念。接下来，使用分发启动器探头开始放大荧光标记放大器的信号，当使用共聚焦显微镜观察时，可产生极小到无背景荧光。放大器可以标有不同的荧光染料，并与不同的探头兼容，旨在识别不同的目标：因此，它们可以同时使用。本协议中描述的程序简单，但耗时（3-4 天）。然而，与使用直接标记荧光探头的其他协议不同，结果的特点是噪声与信号比较低。
这里使用了维罗细胞和HAE培养物。覆盖唇上的细胞和组织培养中的细胞需要不同的协议。在处理细胞（无论是盖滑还是膜）和所用材料量时，会遇到大多数差异。一般RNA-FISH协议要求使用乙醇或甲醇溶液进行渗透，以及在-20°C的夜间孵化。 重要的是，使用洗涤剂进行渗透更有利于免疫荧光，将程序缩短1天，并允许更有效地规划实验。主要做法是遵循涉及酒精或洗涤剂渗透的一般协议，看看是否有任何不良影响是明显的。重要的是，使用70%乙醇溶液对Vero细胞进行隔夜渗透，导致信号异常模糊：相比之下，Tween20的渗透允许清晰和具体地可视化SARS-CoV-2 RNA，并将协议缩短1天（图3）。
在-20°C的绝对甲醇（根据组织样本的一般RNA-FISH协议）和RT.5分钟的0.1%Tween20在RT.与Tween20的孵化导致一个非特定的信号后，对HAE培养物进行了同样的测试，这导致一个非特定的信号，从而取消这种试剂的资格（数据未显示）。甲醇的隔夜孵化导致一个高度特定的信号，没有文物。重要的是，由于甲醇溶解了胶水，因此观察到了特兰斯韦尔膜的分离。此问题通过分离膜和执行盖滑协议来处理。经典的RNA-FISH程序使用蛋白酶K来提高灵敏度，因为这样可以去除蛋白质并清除RNA-蛋白质复合物，使细胞被化学物质和染料渗透。本协议省略了这一步骤，因为蛋白酶K可防止蛋白质染色。当蛋白质酶 K 不存在时，RNA-FISH 的灵敏度没有发现差异（未显示数据）。
在RNA-FISH之后进行免疫荧光检测不会影响RNA信号，并导致两种方法的成功组合。因此，完整的协议是实现RNA及其在单细胞水平上与蛋白质相互作用的便捷方式。值得注意的是，细胞固定（免疫-RNA-FISH所必需）不允许延时实验来检查单细胞水平的动态事件。SARS-CoV-2 RNA的可视化允许分析细胞内的SARS-CoV-2复制，并且，当与免疫荧光相结合时，允许研究细胞内SARS-CoV-2 RNA/宿主蛋白相互作用，包括与表观基因组的相互作用。最后，该协议具有广泛的应用，包括检测SARS-CoV-2和其他新兴病毒的单细胞分辨率。由于敏感和特定的HCR技术，它也可以用作诊断工具。
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Disclosures
作者没有利益冲突可以申报。
Acknowledgments
这项工作得到了科学和高等教育部对SARS-CoV-2研究的支持，并得到了国家科学中心的赠款（向K.P.和UMO-2018/30/E/NZ1/00874赠款给A.K.-P.）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Confocal Microscope LSM 880 | ZEISS | ||
| Grant Bio, Mini Rocker- Shaker | Fisher Scientific | 12965501 | |
| Incubator Galaxy170R | New Brunswick | CO170R-230-1000 | |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf | 5355 000 011 | |
| Materials | |||
| 15 mm x 15 mm NO. 1 coverslips | LabSolute | 7695022 | |
| 1.5 mL tubes | FL-MEDICAL | 5.350.023.053 | |
| 12-well plate | TTP | 92412 | |
| Conical centrifuge tube | Sarstedt | 5.332.547.254 | |
| parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
| serological pipets | VWR Collection | 612-5523P, 612-5827P | |
| slide glass | PTH CHEMLAND | 04-296.202.03 | |
| Transwell ThinCerts | Grainer bio-one | 665641 | |
| Reagents | |||
| Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies | Invitrogen | ||
| β5-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | sc-134234 | |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | |
| Disodium phosphate | Sigma | S51136-500G | |
| EGTA | BioShop | EGT101.25 | |
| HCR Amplification Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BAM01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S013922 | |
| HCR amplifier B1-h2 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S012522 | |
| HCR Probe Hybridization Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPH03821 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR probe set for SARS-CoV-2 Ncapsid | Molecular Instruments, Inc. | PRE134 | |
| HCR Probe Wash Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPW01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HEPES | BioShop | HEP001.100 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 63138-250G | |
| Methanol | Sigma | 32213-1L-M | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655-100G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-1KG | |
| PIPES | BioShop | PIP666.100 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P5405-250G | |
| Prolong Diamond Antifade Mounting Medium | Invitrogen | P36970 | |
| Sodium Chloride | BioShop | SOD001.5 | |
| Trisodium Citrate 2-hydrate | POCH | 6132-04-3 | |
| Tween-20 | BioShop | TWN580.500 | |
| Software | |||
| Fluorescence Spectraviewer | Modeling spectral parameters | ||
| ImageJ Fiji | Acquiring and processing z-stack images |
References
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