Summary
Burada, iletim elektron mikroskopisi (TEM) kullanılarak megakaryositlerin yerinde ultrayapısını analiz etmek için bir protokol sunuyoruz. Murine kemik ilikleri toplanır, sabitlenir, epoksi reçineye gömülür ve ultra ince bölümlerde kesilir. Kontrast boyamadan sonra kemik iliği 120 kV'da TEM mikroskobu altında gözlenir.
Abstract
Megakaryositlerin farklılaşması ve olgunlaşması, kemik iliğinin hücresel ve hücre dışı bileşenleri ile yakın ilişki içinde ortaya çıkar. Bu işlemler, poliploid ve polilobulat çekirdek gibi megakaryosit sitoplazmasındaki temel yapıların, sınır membran sistemi (DMS) adı verilen bir iç membran ağının ve dolaşımdaki trombositlerde bulunacak yoğun ve alfa granüllerinin kademeli olarak ortaya çıkması ile karakterize edilir. Bu yazıda, iletim elektron mikroskopisi (TEM) kullanılarak murine megakaryositlerin yerinde ultrayapısal çalışması için standartlaştırılmış bir protokol açıklanmış haline getirilmiş ve kemik iliğindeki olgunlaşma evrelerini ve hücresel yoğunluklarını tanımlayan temel özelliklerin tanımlanmasını sağlamaktır. Kemik ilikleri yıkanır, sabitlenir, etanolde susuzlur, plastik reçineye gömülür ve kesitler oluşturmak için monte edilir. Histolojik ve TEM gözlemleri için sırasıyla yarı ince ve ince bölümler hazırlanır. Bu yöntem herhangi bir kemik iliği hücresi için, herhangi bir EM tesisinde kullanılabilir ve aynı fare üzerinde birkaç görüntüleme yaklaşımının kombinasyonuna izin sağlayan küçük örnek boyutları kullanma avantajına sahiptir.
Introduction
Megakaryositler, kemik iliğinde lokalize, trombosit üretiminden sorumlu özel büyük poliploid hücrelerdir1. Sitoplazma ve çekirdek2'dekapsamlı eşlik eden morfolojik değişikliklere uğrarken, megakaryosit öncüllerinin giderek arttığı karmaşık bir olgunlaşma süreci yoluyla hematopoetik kök hücrelerden kaynaklanırlar. Olgunlaşma sırasında, megakaryositler aşağıdakiler de dahil olmak üzere bir dizi ayırt edilebilir yapısal eleman geliştirir: polilobürlenmiş bir çekirdek, sınır membran sistemini (DMS) oluşturan yüzey zarının invaginasyonları, aktin bazlı sitoskeletal ağ ile çevrili organellerden yoksun bir periferik bölge ve α granüller, yoğun granüller, lizozomlar ve çoklu Golgi kompleksleri dahil olmak üzere çok sayıda organel. Ultrayapı düzeyinde, gözlenen önemli bir değişiklik, DMS3tarafından sınırlandırılan ayrık bölgelere sitoplazmik bölmelemedir. Bu geniş membran kaynağı, trombosit üretiminin ilk aşamasında uzun sitoplazmik süreçlerin uzatılmasını körükleyecek ve daha sonra sirkülasyonun içindeki trombositlere dönüşecektir. Megakaryosit farklılaşması ve olgunlaşması sırasındaki herhangi bir kusur trombosit sayısı ve/veya trombosit fonksiyonu açısından trombosit üretimini etkileyebilir.
İnce tabaka iletim elektron mikroskopisi (TEM), trombopoezis4,5fizyolojisi anlayışımızı şekillendiren megakaryositlerin yüksek kaliteli ultrayapısını sağlayan onlarca yıldır tercih edilen görüntüleme yaklaşımıdır. Bu makale, herhangi bir kemik iliği hücre tipini analiz etmek için de temel teşkil edebilecek, yerli kemik iliği mikroçevriminde in situ meydana gelen trombosit biyogenez sürecini yakalamaya izin veren standartlaştırılmış bir TEM yöntemine odaklanmaktadır. Sitoplazmik süreçleri sinüzoidlerin mikrosirkülasyonuna genişleten olgunlaşmamışlıktan tamamen olgunluğa kadar megakaryositlerin gelişiminin ultrayapısal örneklerini sunuyoruz6. Ayrıca, kemik iliğinin rejenerasyon ve trombosit üretim kapasitesi konusunda talimat veren farklı megakaryosit olgunlaşma aşamalarını ölçmek için kolay bir prosedür açıklıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri Avrupa standartlarına uygun olarak gerçekleştirildi 2010/63/EU ve CREMEAS Strazburg Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Komitesi (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). protokol şematik olarak Şekil 1'de gösterilmiştir.
1. Kemik iliği toplama ve sabitleme ( Şekil 1A)
DİkKAT: Bu prosedür kanserojen, mutajenik ve/veya toksik maddeleri içerir ve kimyasal ekstraksiyon başlığı altında gerçekleştirilir. Eldiven ve koruma gözlüğü gibi uygun koruyucu ekipmanları giyin.
- Cacodylate tamponunda% 2.5 glutaraldehitden oluşan fiksatif çözeltiyi hazırlayın(bkz. Ek Dosya).
- Kemik iliği toplama
- Her iki cinsiyette de yetişkin C57BL / 6 fareleri kullanın 12-18 haftalık. Fareleri CO2 boğulma ve servikal çıkık ile ötenazi.
- Bir çift ince makasla, uyluğun etrafındaki cildi kesin ve cildi soymak için cımbız kullanın. Pençenin ekstremitesini çıkarın ve ardından kalça ve uyluk arasında kesin. Diz eklemlenmesinde keserek kaval kemiğini uyluk kemiğinden ayırın ve neşter kullanarak kaval kemiği ve uyluk kemiği üzerindeki yapışık dokuyu çıkarın.
- Epifizleri keskin bir jiletle çıkarın. Uyluk kemiğini cımbızla tutarken, kemik iliğini 2 mL kakodylat tamponu ile dolu 15 mL'lik bir tüpe yıkamak için 21 G iğneli kakodylat tamponu ile dolu 5 mL şırınga kullanın. Bunu yapmak için, iğnenin eğimini kemik iliği açıklığı içine yerleştirin ve ilik dışarı atılana kadar pistona yavaşça bastırın.
- Fiksatif içine hızlı daldırma ile kemik iliği fiksasyonu.
- Yıkamadan hemen sonra, kemik iliği silindirini oda sıcaklığında 60 dakika boyunca 1 mL taze glutaraldehit fiksatif çözeltisine (daha önce 1,1'de hazırlanmış) aktarmak için plastik bir pipet kullanın.
NOT: Dokuyu korumak için kemik diseksiyonundan fiksasyon adımına kadar tüm işlemin 10 dakikadan kısa sürede tamamlandığından emin olun. Fiksasyon için, ısı şokunu önlemek için fiksatif çözeltinin oda sıcaklığında olduğundan emin olun.
- Yıkamadan hemen sonra, kemik iliği silindirini oda sıcaklığında 60 dakika boyunca 1 mL taze glutaraldehit fiksatif çözeltisine (daha önce 1,1'de hazırlanmış) aktarmak için plastik bir pipet kullanın.
2. Kemik iliğini agarose içine gömmek
NOT: İlik dokusu farklı yıkama adımları sırasında bütünlüğünü korumak için yeterince uyumlu değildir ve malzeme kolayca kaybolabilir. Bu sorunun üstesinden gelmek için, ilik dehidrasyondan önce bir agar jeli ile kaplanır.
- Agarose çözeltisini Ek Dosya 'da açıklandığı gibi hazırlayın.
- Bölüm 1.3'teki sabit iliği kaktüs tamponunda yıkayın ve plastik bir pipet kullanarak dikkatlice cam bir slayda aktarın. Ilık bir pipet kullanarak, kemik iliği silindirine hızlı bir şekilde% 2 sıvı agar damla uygulayın.
NOT: Agar soğurken hızlı bir şekilde katılanın. Kemik iliğinin homojen bir şekilde kaplanmasını sağlamak için, agar çözeltisinin kaydırağa birikene kadar sıcak tutulması gerekir. - Agar katılanıncaya kadar (1-2 dk) kaydırağı hızla buza yerleştirin.
- Mikroskop altında, bu bölgelerdeki olası doku sıkışması nedeniyle kemik iliği silindirinin ekstremitelerini kesmek ve atmak için keskin bir jilet kullanın. İlik bloklarını 1 mL kakadodylat tampon içeren 1,5 mL mikrosantrifüj tüplere aktarın.
3. Kemik iliğini reçineye gömmek
DİkKAT: Reçine bileşenleri toksiktir; bazıları kanserojendir ve kimyasal ekstraksiyon başlığı altında özenle ele alınmalıdır. Eldiven ve koruma gözlüğü gibi uygun koruyucu ekipmanları kullanın. Osmiyum tetroksit oda sıcaklığında oldukça uçucudur ve buharları göz, burun ve boğaz için çok zararlıdır. Atılmadan önce, % 2 osmiyum tetroksit, bitkisel yağ hacminin iki katı eklenerek nötralize edilmelidir.
- Ek Dosya 'da açıklandığı gibi epoksi reçinesini hazırlayın.
- Reçine gömme
NOT: Osmiyum, uranil asetat ve etanol ardışık banyolarda inkübasyonlar sırasında numuneleri aynı mikrosantrifüj tüplerinde saklayın. Üstleri pasteur pipetle aspire edin. Her banyo için kullanılan çözelti hacmi, numunenin hacminin en az 10 katını eşit olmalıdır.- Blokları 4 °C'de 1 saat boyunca kaktüs tamponunda% 1 osmiyum ile sabitle, bir kez cacodylate tamponunda ve sonra bir kez damıtılmış suda yıkayın.
- Damıtılmış suda% 4 uranil asetat ile 1 saat leke, damıtılmış suda iki kez yıkayın.
- Damıtılmış suda dereceli bir etanol serisinden susuzluk: 5 dakika boyunca% 75 etanolde 4 kez, ardından 20 dakika boyunca% 95 etanolde 3 kez ve ardından 20 dakika boyunca% 100 etanolde 3 kez. Bu adımda, dondurucudan bir şırınna epoksi reçinesi alın.
NOT: Protokol 1 saat boyunca% 100 etanolde duraklatılabilir. - İliğin içindeki epoksi reçinesinin tek tip infiltrasyonunu ve polimerizasyonunu elde etmek için, önce 15 dakika boyunca 2 ardışık propilen oksit banyosundaki blokları kuluçkaya yatırın.
- % 100 propilen oksit ve epoksi reçine karışımı ekleyin ve 1 saat kuluçkaya yatırın. Numuneleri oda sıcaklığında yavaş bir döner çalkalayıcıya yerleştirin.
- % 100 epoksi reçine ekleyin, numuneyi ajitasyon altında gece kuluçka için bırakın.
- 2 saat inkübasyon için% 100 epoksi reçine ekleyin, hala ajitasyon altında.
- Mikroskop altında, ilik bloklarını düz silikon kalıplara yerleştirin. Tüm kemik iliğinin daha sonra transversal kesitlerine izin vermek için örnekleri yönlendirin. Kalıpları epoksi reçine ile doldurun ve 48 saat boyunca 60 ° C'ye yerleştirin.
NOT: Numunelerin kirlenmesini önlemek için tüm çözeltiler (etanol ve propilen oksit hariç) 0,22 μm filtreden süzülür. Reçinenin yeterli polimerizasyonunu sağlamak için kalıpları doldururken kabarcıklardan kaçının.
4. Ultra ince kesitleme (Şekil 1B)
NOT: İletim EM, elektronların hücrelerin iç kısmının, yapısının ve iç organellerin (granüller, endoplazmik retikulum, Golgi) organizasyonu ve hücre içi hücre zarlarının düzenlenmesinin projeksiyon görüntüsünü oluşturabileceği ince doku bölümleri gerektirir.
- Numune bloğunu ultra mikrotom desteğine monte edin. Örnek tutucuya koy. Dönen bir elmas veya tungsten frezeleme kesicisi ile doku etrafındaki reçine fazlalığını gidermek için numuneleri 45 ° 'de kırpın.
- Numuneleri su tankı ile donatılmış elmas bıçak bıçağı ile ultramikrotom üzerine monte edin. Histolojik ve TEM analizleri için sırasıyla 500 nm ve 100 nm kalınlığında enine kesitler kesin. Su yüzeyinde yüzen bölümleri bir döngü ile toplayın.
- 500 nm kalınlığındaki bölümü cam bir kaydırağa ve 100 nm kalınlığındaki bölümleri altında kağıt filtre bulunan 200 örgü ince çubuk bakır ızgaralara yatırın. Bir koşul için beş ızgara hazırlayın: önce iki ızgarayı lekelenin ve gerekirse kalan üç ızgarayı yedek olarak tutun.
5. Histoloji için Toluidin mavi boyama
NOT: Histoloji için lekeleme bölümleri üç nedenden dolayı önemlidir: 1) reçinenin değil, dokunun gerçekten kesildiğinden emin olmak, 2) inklüzyonun kalitesini kontrol etmek ve 3) ilik örneğini hızlı bir şekilde değerlendirmek. Bu doğru değilse, bloğun daha derinini kesin.
- Yarı ince bölümleri bir ısı plakasında (60 °C) kaydırın.
- Slaytlara damıtılmış suya filtrelenmiş% 1 toluidin mavisi / % 1 sodyum borat ekleyin ve 1-2 dakika boyunca sıcak bir plakada (60 ° C) ısıtın. Slaytları damıtılmış suyla yıkayın ve ısı plakasında kurumasına izin verin.
- Bölümleri bir damla Poli (butil methakrilat-co-metil methakrilit) montaj ortamı ile kapaklara monte edin ve hafif bir mikroskop altında inceleyin.
6. TEM gözlemi için ağır metal boyama (Şekil 1C)
NOT: Kontrast için, ızgaraların üst tarafı, ardışık her banyonun 100 μL damlasına bir döngü ile ters çevrilir. Kullanmadan önce, her çözelti 0,22 μm filtrelenmiştir. Bir filtre kağıdı üzerinde ızgara tarafına hafifçe temas derek her banyo arasındaki fazla sıvıyı çıkarın.
- 5 dakika boyunca damıtılmış suda% 4 uranil asetat ile leke.
- Damıtılmış suda 3 kez 5 dakika yıkayın.
- 3 dakika boyunca kurşun sitratlı leke.
- Damıtılmış suda 3 kez 5 dakika yıkayın.
- Izgaraları kurumasını sağlamak için filtre kağıdıyla temas halinde alt tarafa yatırın.
NOT: Ağır metaller karbondioksit varlığında reaksiyona sokur. Çökeltmeleri en aza indirmek için kontrast sırasında havanın yer değiştirmesini önleyin, konuşmayın, ortamı sakin tutun ve klimayı kapatın.
7. TEM (Şekil 1E)
NOT: Bölümler TEM mikroskopunda tanıtılır ve 120 kV'da incelenir.
- İlk olarak, preparatın genel yönünü takdir etmek için düşük büyütmedeki bölümleri (< 500x) inceleyin (reçinede delik olmaması, bölümlerde kıvrımlar / sıkıştırma, lekelenme nedeniyle çökeltiler).
- Daha sonra bölümleri daha yüksek büyütmede inceleyin (~ olgunlaşma aşamasını ayırt etmeye izin vererek~ 2000x). Olgunlaşmanın her aşamasındaki megakaryositleri tüm transversal bölümler üzerinde manuel olarak sayın (bkz. Her aşamanın görsel olarak nasıl tanımılacağına ilişkin Temsili Sonuçlar).
NOT: Izgaraların her karesi inceleme alanı olarak tanımlanır (200 örgü bakır ızgara için 16000 μm2'ye eşittir). - Megakaryosit sayısını değerlendirmek için, yalnızca bir bölümle tamamen kaplı kareleri ölçün. Bunu yapmak için aralıkların taranmasını temel alan bir model kullanın. Bölümün bir ekstremitesinden diğerine, daha sonra aynı şekilde başka bir aralık vb. Bu prosedürü kullanarak, tüm ilik transversal bölümünü kare kare tarayın.
- Her kare için Aşama I, II veya III megakaryosit sayısını puanla.
NOT: Granülleri, DMS organizasyonunu, sitoplazmik bölgelerin boyutunu ve polilobulatlanmış çekirdeği analiz etmek için daha yüksek büyütmeler gereklidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kemik iliği histolojisi
Kemik iliği toluidin mavi histolojisinin hafif bir mikroskop altında gözlemlenmesi, doku kompaktlığı, mikrovessel sürekliliği ve megakaryositlerin büyüklüğü ve şekli açısından genel doku mimarisini hızlı bir şekilde analiz etmek için anahtardır (Şekil 1D). Kemik iliği bloğunda daha derin kesme ihtiyacını belirlemek için ultra ince bölümlerden önce gerçekleştirilir. Dev boyutları ve nükleer lobülasyonları nedeniyle, daha olgun megakaryositler 40x hedefle kolayca görselleştirilebilir. Bu, dokudaki olgun megakaryositlerin yoğunluğuna ve mikrovessellere göre lokalizasyonlarına mükemmel ve hızlı bir genel bakış sağlar. Megakaryosit çoğalması ve olgunlaşmasındaki anomaliler bu tür yarı ince bölümlerde zaten tespit edilmiş olabilir.
Kemik iliği ultrayapı
Farklı ultrayapısal özellikler temelinde, murine megakaryositler olgunlaşmalarında sıralı aşamaları temsil eden 4 aşamaya ayrılır (Şekil 2A). Aşama I megakaryositler, hücrenin çoğunu kaplayan ve bol miktarda ribozom ve kaba endoplazmik retikülü içeren büyük bir çekirdek ile 10-15 μm çapındadır. DMS öncesi olarak adlandırılan DMS'nin en erken tespit edilebilir aşamasının varlığı, TEM analizinde aşama IK'ları ayırt etmek için de önemli bir kriterdir3. Olgunlaşmanın II. aşamasında granül oluşumu başlar ve DMS'nin gelişimine başlanır. Megakaryositlerin boyutu artar, çapı 15-25 μm'dir ve nükleer lobülasyon geliştirir. Olgun evre III megakaryositler 25-50 μm çapında dev hücrelerdir. Sitoplazmaları, açıkça tanımlanmış sitoplazmik bölgelere ve organellerden yoksun bir çevresel bölgeye sahip iyi gelişmiş bir DMS içerir. Bu aşamada, çekirdek genellikle eksantrik olarak bulunur ve nükleer zarda bulunan yoğun kromatin ile çok düzensiz görünür. Son adım, sitoplazma kütlesi ortadan kaldırıldıktan sonra plazma zarı ile çevrili büyük bir çekirdeklerden oluşan pirenosite olarak da adlandırılan çıplak bir çekirdek ile karakterizedir. Vahşi tip C57BL/6 farelerde kemik iliği yaklaşık% 8 evre I,% 20 aşama II,% 71 evre III megakaryositler ve <% 1 pirenitelerden oluşur. Ortalama megakaryosit sayısı kare başına 1,7 ila 2,2 hücre arasındadır. Bu rastgele sınıflandırma, sürekli bir hücre farklılaşma sürecini rahatça izlemeyi ve olası anomalilerini tespit etmeyi sağlar.
Olgunlaşmanın bu klasik aşamalarının yanı sıra, kemik iliğindeki sabit megakaryositlerin gözlemlenmesi, megakaryositler sinüzoidal duvarla etkileşime girerken meydana gelen olaylar dizisini analiz etmeyi sağlar (Şekil 2B). Endotel hücreleri ile temas eden megakaryositler ince kesitlerde sıklıkla gözlenir. Bazen endotel nüfuz eden veya sitoplazmının büyük projeksiyonunu sinüzoidallümen 7,8'e genişleten kısa invaziv çıkıntılar oluşturan megakaryositleri gözlemler. Dikkat çekici bir şekilde, bu intravasküler sitoplazmik işlemler değişken boyutları, uzunlukları ve çapları görüntüleyerek dolaşımdaki progresif trombosit tadilatını göstermektedir. Genel dolaşımda zaten mevcut olan trombositler, çevresel mikrotübül bobinleri tarafından tutulan diskoid bir şekle sahip, sinüzoidlerin lümeninde de görülebilir. Trombositlerin bu tipik morfolojisi, numunenin doğru sabitlemesinin göstergesidir.
İletim elektron mikroskopisi, nükleer lobülasyon, DMS'nin uzamsal organizasyonu ve granüller gibi ultrayapısal ayrıntıları boyut, şekil ve dağılım açısından görselleştirmek için gereken çözünürlük seviyesine sahiptir. Şekil 2C, α granülleri, Golgi sarnıcı, mitokondri ve endoplazmik retikülün varlığını gösteren bir aşama III megakaryositteki perinükleer bölgeye bir örnektir. Şekil 2C'de ayrıca dikkat çekici olan, alfa ve yoğun granüllerin oluşumunda bir ara aşamayı temsil eden, çapı9,10olan 200 Å'dan daha az olan katlar ekzozomları içeren çokvesiküler bir gövdedir. Son olarak, iletim elektron mikroskopisi, bir hücrenin başka bir canlı hücreye nüfuz ettiği emperipolezis adı verilen nadir bir işlemi takiben, megakaryositlerin içinde bulunan nötrofilleri ve diğer hematopoetik hücreleri görselleştirmeyi sağlar11. Normal fizyolojik durumdaki megakaryositlerin %4'ünü ilgilendiren bu süreç, belirli patolojik koşullarda önemli ölçüde arttırılabilir12.
Şekil 1: Deneysel kurulumun şematik çizimi. (A) Kemik iliği gömme işlemi. Kemik iliği glutaraldehit çözeltisinde hızlı daldırma ile yıkanır ve sabitlenir. Fotoğraf, yıkamadan sonra kemik iliği silindirinin tipik görünümünü göstermektedir. Oda sıcaklığında 1 saat sabitlemeden sonra, ilik agarose ile çevrili, osmiyum tetroksitte post-sabitlenir ve uranil asetat içinde inkübe edilir. Dokular daha sonra tamponda durulanır, bir dizi dereceli etanolde susuz, propilen oksitte inkübe edilir ve epoksi reçine ile sızılır. (B) Kemik ilikleri kesitleri engeller. Gömülü kemik iliği bir ultramikrotom tutucuya monte edilir, 45° olarak kesilir ve yarı ince (500 nm) veya ince (100 nm) bölümler halinde kesilir. Ultrayapısal çalışmalar için, yüzen bölümler bir döngü ile alınır ve altında bir kağıt filtre bulunan ızgaralara biriktirilir. (C) TEM gözlemleri için kontrast boyama. Izgaralar uranil asetat damlaları üzerinde ters çevrilir, damıtılmış su damlalarında yıkanır ve başka bir yıkama çalışmasından önce kurşun sitrat üzerine inkübe edilir. Kuruduktan sonra (bölümlerin üst tarafı) numuneler TEM altında incelenmek üzere hazırdır. (D) Toluidin mavisi ile boyanmış fare femoral ilik bölümünün histolojisi. Dev hücreler olgun megakaryositlere (1) karşılık gelir, bazıları sinüzoidlerle temas halindedir (2). Sinüzoidler büyük bir merkezi sinüs damarı üzerinde birleşir (3). Çubuk: 20 μm. İç: 40x büyütmede olgun bir megakaryosit normal görünümü. (E) Düşük büyütmede kemik iliği bölümünün temsili TEM görüntüsü. Hücreler çok az hücre dışı alanla sıkıca doludur. Bölümün her ızgara karesi, şematik oklu yolu (kırmızı oklar) izleyerek bir ekstremiteden diğerine gözlenir. Bar: 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2 : Megakaryositlerin yerinde görüntüleri ultrayapı. (A) Vahşi tip megakaryositlerin karakteristik olgunlaşma aşamaları. Megakaryositler dört olgunlaşma aşamasında sınıflandırılır: Aşama I, büyük bir çekirdeğe sahip 10-15 μm çapında bir hücre; aşama II, geliştirilmekte olan DMS'yi içeren 15-30 μm çapında bir hücre; evre III, sitoplazmik bölgeleri tanımlayan ve organel içermeyen bir çevre bölgesine sahip iyi gelişmiş bir sınır membran sistemi (DMS) içeren 30-50 μm hücre. Bir pirenofit, tam sitoplazmik uzantıyı takiben kemik iliğinde kalan çıplak polilobülatılmış çekirdeğe karşılık gelir. Çubuklar: 10 μm (B) Megakaryosit-endotel hücre etkileşimleri ve intravasküler sitoplazmik süreçler. (i) Bir megakaryosit periferik bölgesi (PZ) sinüzoidal endotelin abluminal yüzeyine yakından yapıştırılır. (ii) Endotel tabakasına (ok uçları) derinlemesine nüfuz eden kısa invaziv çıkıntılar oluşturan bir megakaryosit. (iii-v) Oklar, bazıları çok büyük olan ve kan dolaşımına yeni giren parçaları temsil edebilecek bir çevresel bölgeye sahip olan çeşitli çaplara sahip megakaryositlerin sitoplazmik süreçlerini göstermektedir. (vi) Sinüs lümeninde gözlenen tipik bir diskoid trombosit (P). Her mikrografide kırmızı çizgi endotel bariyerinin ışıklı tarafını, yıldız ise sinüzoid lümenini gösterir. Çubuklar: 2 μm. (C) Olgun bir megakaryosit perinükleer bölgesinin daha yüksek büyütmeleri. α, alfa granül; rer, kaba endoplazmik retikülyum; G, golgi; MVB, çok amaçlı gövde; m, mitokondri. Çubuk: 0,5 μm. (D) Emperipolez gösteren megakaryosit örneği. Yutulan nötrofil, megakaryositlerle etkileşim tarafından morfolojik olarak değişmemiş olarak görünür. Bar: 2 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya: Reaktiflerin hazırlanması. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Megakaryositlerin kendi ortamlarında doğrudan incelenmesi, megakaryopoez ve trombosit oluşumunu anlamak için gereklidir. Bu yazıda, kemik iliğinde gerçekleşen megakaryosit morfogenezinin tüm sürecinin morfoloji özelliklerini yerinde inceleyerek kemik iliği yıkama ve fiksasyonunu daldırma ile birleştiren bir iletim elektron mikroskopi yöntemi sunuyoruz.
Kemik iliğinin yıkanması bu yöntemin kritik bir adımıdır, çünkü yüksek kaliteli bir yıkamanın başarısı operatörün uygulamasına ve eğitimine bağlıdır. Hassas olmasına rağmen, kemik iliğini yıkamak, genellikle megakaryosit morfolojisinde önemli eserlerle ilişkili tam kireç giderme için 2 haftalık bir EDTA tedavisi gerektiren mineralize kemiğin çıkarılmasını önlemenin en iyi yoludur. Ek olarak, kaval kemiği ve uyluk kemiğinden tüm düzeltilmemiş kemik iliklerini toplamanın en büyük avantajı, aynı fareye birkaç görüntüleme yaklaşımını birleştirme yeteneğidir. Pratikte, ultrayapısal çalışma için sadece tek bir kemik iliği gereklidir, diğer üç örnek tamamlayıcı analizler için kullanılabilir. İkinci kemik iliği daha sonra taze kemik iliği eksplantlarının hazırlanması için kullanılabilir, gerçek zamanlı olarak yerli megakaryositlerin proplatelet oluşumunun dinamiklerini incelemek için6. Üçüncü örneklem genellikle kalın bölümler üzerinde immünositleme çalışmaları için tasarlanmıştır ve megakaryositlerin doğal ortamlarında 3D görüntüleme ve dağılımını sağlar. Son örneklem dondurulabilir ve proteinlerin hücre altı lokalizasyonunun yüksek çözünürlükte araştırıldığı immünogold elektron mikroskopisi ile daha fazla çalışma için saklanabilir4. Bu kombine görüntüleme yöntemleri, bir faredeki genlerin hedeflenen silinmesinin/ mutasyonunun mevcudiyeti ile birlikte, trombopoezde belirli bir proteinin biyolojik rolünü yerinde olarak ifade etmenin önemli bir yolu sağlar. Bununla birlikte, burada bu yöntemin bir sınırlamasının iliği yıkamak için gereken epifizlerin çekilmesi olduğu belirtilmelidir. Epifizlerin hematopoez için önemli alanlar olduğu bilinmektedir ve bu nedenle çıkarılması hematopoetik kök hücreleri ve etkileşimin ilk aşamalarını analiz etme olasılığını engeller13. Diğer bir sınırlama, olgunlaşmamış aşamadan önce megakaryositlerin atalarının tanımlanamamasıdır, çünkü bu hücreler belirli ultrayapısal özelliklere sahip değildir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için em immünogold yaklaşımı kullanılabilir.
Yöntemin ikinci önemli adımı daldırma ile kemik iliği fiksasyonudur. Burada açıklanan koşullar altında gerçekleştirildiğinde, yani, kompakt kemik iliği silindirini sifonu çektikten hemen sonra sabitleme aşağıdaki avantajlara sahiptir: (i) hızlı ve kolay gerçekleştirilir, (ii) perfüzyon6ile sabitlenmeyi takiben gözlemlenene yakın bir ultrayapıyı korur ve (iii) sinüzoid kan dolaşımında aksi takdirde perfüzyondan sonra boşaltılan / kaybolan serbest megakaryosit işlemlerini ve trombositlerini korur. Bu teknikle megakaryositlerin sinüzoidal dolaşıma girişini araştırmak ve trombositlerin ortaya çıktığı sitoplazmik süreçlerin tüm ara formlarını karakterize etmek mümkündür8. Buna paralel olarak, son zamanlarda megakaryositlerden in vivo intravazyonların yapısal olarak megakaryositlerin in vitro, özellikle mikrotübüllerin farklı bir düzenlemesi ile oluşan ince uzantılardan farklı olduğu bildirilmiştir7. Benzer şekilde, son zamanlarda trombosit oluşumunu yöneten mekanizmanın in vivo tanımlanan in vitro14.
In vitro kültürlü ve in vivo üretilen yerli megakaryositler arasında önemli ultrayapısal farklılıklar giderek daha fazla tanınmakta ve tam bir megakaryosit farklılaşması / olgunlaşması için kemik iliği mikroçevrasyonuna duyulan ihtiyacın altını çizmektedir. Bu makalede açıklanan daldırma ile kemik iliği yıkama ve fiksasyon kombinasyonunun ardından, geleneksel iletim elektron mikroskopisi, fizyolojik ve patolojik koşullar altında megakaryosit biyolojisi ve trombosit oluşumunu incelemek için hala paha biçilmez bir araç olmaya devam etmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan edecekleri çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar teknik yardım için Fabienne Proamer, Jean-Yves Rinckel, David Hoffmann, Monique Freund'a teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), Avrupa Birliği tarafından Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (ERDF) ve Grant ANR-17-CE14-0001-01 tarafından H.d.S.'ye desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30) | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar | Electron Microscopy Sciences, USA | 1670-B | |
| CaCl2 Calcium chloride hexahydrate | Merck, Germany | 2083 | |
| Copper grids 200 mesh thin-bar | Oxford Instrument, Agar Scientifics, England | T200-CU | |
| Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate | Merck, Germany | 8.20670.0250 | |
| Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA) | Ladd Research Industries, USA | 21340 | |
| Double Edge Stainless Razor blade | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | EM-72000 | |
| Ethanol absolut | VWR International, France | 20821296 | |
| Filter paper, 90 mm diameter | Whatman, England | 512-0326 | |
| Flat embedding silicone mould | Oxford Instrument, Agar Scientific, England | G3533 | |
| Glutaraldehyde 25% | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 16210 | |
| Heat plate Leica EMMP | Leica Microsystems GmbH, Austria | 705402 | |
| Histo Diamond Knife 45° | Diatome, Switzerland | 1044797 | |
| JEOL 2100 Plus TEM microscope | JEOL, Japan | EM-21001BU | |
| Lead citrate - Ultrostain 2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 70 55 30 22 | |
| LX-112 resin | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate | Sigma, France | M2393-100g | |
| Mounting medium - Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 15320 | |
| Nadic Methyl Anhydride (NMA) | Ladd Research Industries, USA | 21350 | |
| Osmium tetroxide 2% | Merck, Germany | 19172 | |
| Propylene oxide (1.2-epoxypropane) | Sigma, France | 82320-250ML | |
| Saline injectable solution 0.9% NaCl | C.D.M Lavoisier, France | MA 575 420 6 | |
| Scalpel Surgical steel blade | Swann-Morton, England | .0508 | |
| Sodium tetraborate - Borax | Sigma, France | B-9876 | |
| Sucrose | Merck, Germany | 84100-1KG | |
| Syringe filter 0.2µm | Pall Corporation, USA | 514-4126 | |
| Toluidine blue | Ladd Research Industries, USA | N10-70975 | |
| Trimmer EM TRIM2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 702801 | |
| Ultramicrotome Ultracut UCT | Leica Microsystems GmbH, Austria | 656201 | |
| Uranyl acetate | Ladd Research Industries, USA | 23620 |
References
- Machlus, K. R., Italiano, J. E. The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation. The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
- Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C. Structural changes in the megakaryocytes of patients infected with the human immune deficiency virus (HIV-1). American Journal of Pathology. 134 (6), 9 (1989).
- Eckly, A., et al. Biogenesis of the demarcation membrane system (DMS) in megakaryocytes. Blood. 123 (6), 921-930 (2014).
- Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. , 1-10 (2020).
- Behnke, O., Forer, A. From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream. European Journal of Haematology. 60, 3-23 (2009).
- Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Platelets and Megakaryocytes. 788, 175-192 (2012).
- Brown, E., Carlin, L. M., Nerlov, C., Lo Celso, C., Poole, A. W. Multiple membrane extrusion sites drive megakaryocyte migration into bone marrow blood vessels. Life Science Alliance. 1 (2), 201800061 (2018).
- Eckly, A., et al. Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids. Journal of Thrombosis and Haemostasis. , 15024 (2020).
- Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
- Heijnen, H. F. G., Debili, N., Vainchencker, W., Breton-Gorius, J., Geuze, H. J. Multivesicular Bodies Are an Intermediate Stage in the Formation of Platelet α-Granules. Blood. 7 (7), 2313-2325 (1998).
- Gupta, N., Jadhav, K., Shah, V. Emperipolesis, entosis and cell cannibalism: Demystifying the cloud. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 21 (1), 92 (2017).
- Centurione, L., et al. Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1low mice. Blood. 104 (12), 3573-3580 (2004).
- Ellis, S. L., et al. The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
- Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. , (2020).
