من الخلايا إلى تخليق البروتين الخالي من الخلايا في غضون 24 ساعة باستخدام سير عمل الحث التلقائي الخالي من الخلايا
Summary
يصف هذا العمل تحضير مستخلص الخلايا من الإشريكية القولونية (E. coli ) متبوعا بتفاعلات تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) في أقل من 24 ساعة. يشرح شرح بروتوكول الحث الذاتي الخالي من الخلايا (CFAI) بالتفصيل التحسينات التي تم إجراؤها لتقليل إشراف الباحثين وزيادة كميات مستخلص الخلايا التي تم الحصول عليها.
Abstract
نمت توليف البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) كمنصة للتكنولوجيا الحيوية تلتقط آلات النسخ والترجمة في المختبر. جعلت العديد من التطورات منصة CFPS أكثر سهولة للمستخدمين الجدد ووسعت نطاق التطبيقات. بالنسبة لأنظمة CFPS القائمة على التحلل ، يمكن توليد مستخلصات الخلايا من مجموعة متنوعة من الكائنات الحية ، وتسخير الكيمياء الحيوية الفريدة لهذا المضيف لزيادة تخليق البروتين. خلال السنوات ال 20 الماضية ، أصبحت الإشريكية القولونية (E. coli) واحدة من أكثر الكائنات الحية استخداما على نطاق واسع لدعم CFPS بسبب قدرتها على تحمل التكاليف وتنوعها. على الرغم من العديد من التطورات الرئيسية ، ظل سير العمل لإعداد مستخلص خلايا E. coli عنق الزجاجة الرئيسي للمستخدمين الجدد لتنفيذ CFPS لتطبيقاتهم. يستغرق سير عمل إعداد المستخلص وقتا طويلا ويتطلب خبرة فنية لتحقيق نتائج قابلة للتكرار. للتغلب على هذه الحواجز، أبلغنا سابقا عن تطوير سير عمل الحث التلقائي (CFAI) الخالي من الخلايا على مدار 24 ساعة والذي يقلل من مدخلات المستخدم والخبرة التقنية المطلوبة. يقلل سير عمل CFAI من العمالة والمهارة التقنية المطلوبة لتوليد مستخلصات الخلايا مع زيادة إجمالي كميات مستخلصات الخلايا التي تم الحصول عليها. هنا نصف سير العمل هذا بطريقة خطوة بخطوة لتحسين الوصول ودعم التنفيذ الواسع النطاق ل CFPS القائم على E. coli.
Introduction
نما استخدام تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية بشكل كبير خلال السنوات القليلة الماضية1،2،3. ويمكن أن يعزى هذا التطور جزئيا إلى زيادة الجهود المبذولة لفهم العمليات التي تحدث في CFPS ودور كل مكون 4,5. بالإضافة إلى ذلك ، فإن انخفاض التكاليف المنسوبة إلى الإعدادات المحسنة ومصادر الطاقة البديلة جعلت التكنولوجيا الخالية من الخلايا أسهل في التنفيذ للمستخدمين الجدد6،7،8،9. من أجل تنفيذ عوامل النسخ والترجمة اللازمة لتخليق البروتين ، غالبا ما يستخدم مستخلص الخلايا لدفع التفاعلات الخالية من الخلايا10. قدمت أدلة المستخدم المنشورة مؤخرا بروتوكولات بسيطة لإنتاج مستخلص وظيفي ، مما يسهل تنفيذه للمستخدمين الجدد وذوي الخبرة على حد سواء 1،11،12،13،14. عادة ما يتم الحصول على مستخلص الخلايا من خلال تحلل مزرعة الخلايا ، والتي يمكن زراعتها باستخدام كائنات حية مختلفة اعتمادا على الاستخدام المحدد المطلوب1،15،16.
أصبحت الإشريكية القولونية (E. coli) بسرعة واحدة من الكائنات الحية المضيفة الأكثر استخداما لإنتاج مقتطفات وظيفية17. يفضل سلالة BL21 Star (DE3) لأنها تزيل البروتياز من الغشاء الخارجي (OmpT protease) والسيتوبلازم (Lon protease) ، مما يوفر بيئة مثالية لتعبير البروتين المؤتلف. بالإضافة إلى ذلك ، يحتوي DE3 على λDE3 الذي يحمل جين بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 (T7 RNAP) تحت سيطرة مروج lacUV5 ؛ يحتوي المكون النجمي على جين RNaseE متحور يمنع انقسام الحمض النووي الريبوزي المرسال4،14،18،19. تحت مروج lacUV5 ، يسمح تحريض الأيزوبروبيل ثيوجالاكتوبيرانوسيد (IPTG) بالتعبير عن T7 RNAP20,21. تستخدم هذه السلالات لزراعة وحصاد الخلايا ، والتي تعطي المواد الخام لإعداد المستخلص. يمكن إجراء تحلل الخلايا باستخدام مجموعة متنوعة من الطرق ، بما في ذلك ضرب الخرز ، والصحافة الفرنسية ، والتجانس ، والصوتنة ، وتجويف النيتروجين1،11،12،22.
عملية الزراعة البكتيرية والحصاد متسقة عبر معظم المنصات عند استخدام الإشريكية القولونية، ولكنها تتطلب عدة أيام وإشرافا مكثفا من الباحثين1،11،13. تبدأ هذه العملية عموما بزراعة البذور بين عشية وضحاها في مرق LB ، والذي عند النمو بين عشية وضحاها يتم تلقيحه بعد ذلك في ثقافة أكبر من 2xYTPG (الخميرة ، التربتون ، الفوسفات العازل ، الجلوكوز) في اليوم التالي. تتم مراقبة نمو هذه الثقافة الأكبر حتى تصل إلى مرحلة السجل المبكرة إلى المتوسطة ، بكثافة بصرية (OD) تبلغ 2.514,20. مطلوب قياس مستمر حيث ثبت سابقا أن مكونات النسخ والترجمة نشطة للغاية في مرحلة السجل المبكر إلى المتوسط23,24. في حين أن هذه العملية يمكن أن تخلق مستخلصا قابلا للتكرار ، فقد طور مختبرنا مؤخرا طريقة جديدة باستخدام وسائط الحث التلقائي الخالية من الخلايا (CFAI) ، مما يقلل من إشراف الباحثين ، ويزيد من العائد الإجمالي للمستخلص للتر معين من زراعة الخلايا ، ويحسن الوصول إلى إعداد المستخلص القائم على الإشريكية القولونية لكل من المستخدمين ذوي الخبرة والجدد (الشكل 1 ). نقدم هنا الدليل خطوة بخطوة لتنفيذ سير عمل CFAI ، للانتقال من لوحة مخططة من الخلايا إلى تفاعل CFPS مكتمل في غضون 24 ساعة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك حاجة تقليديا إلى إشراف الباحث لإجراءين رئيسيين أثناء نمو الخلايا: تحريض T7 RNAP وحصاد الخلايا في OD600 محدد. CFAI يتجنب كل من هذه المتطلبات لتقليل وقت الباحث والتدريب الفني المطلوب من أجل إعداد مستخلصات الخلايا عالية الجودة. يتم تحقيق الحث التلقائي ل T7 RNAP عن طريق استبدال الجلوكوز باللا…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يعربوا عن تقديرهم للدكتورة جنيفر فاندركيلين وأندريا لاوبشر على الدعم الفني. يود المؤلفون أيضا أن يشكروا نيكول غريغوريو وماكس ليفين وأليسا مولين وبيونغ تشول سو وأوغست بروكويل وإليزابيث (ليزي) فويفودا ولوغان بورينغتون وجيليان كاسمان على المناقشات المفيدة. يعترف المؤلفون أيضا بدعم التمويل من صندوق بيل وليندا فروست ، ومركز التطبيقات في منحة شيفرون للبحوث التطبيقية للتكنولوجيا الحيوية ، وأبحاث كال بولي ، والعلمية ، والمؤسسة الوطنية للعلوم (NSF-1708919).
Materials
| 1.5 mL Microfuge Tubes | Phenix | MPC-425Q | |
| 1L Centrifuge Tube | Beckman Coulter | A99028 | |
| Avanti J-E Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C3144-25MG | |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT5F | |
| D-Glucose | Fisher | D16-3 | |
| D-Lactose | Alfa Aesar | J66376 | |
| DTT | ThermoFisher | 15508013 | |
| Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-100G | |
| HEPES | ThermoFisher | 11344041 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| JLA-8.1000 Rotor | Beckman Coulter | 366754 | |
| K(Glu) | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| K(OAc) | Sigma-Aldrich | P1190-1KG | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P5958-500G | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A7627-100G | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A8094-25G | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A0884-25G | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A7219-100G | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352-25G | |
| L-Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126-250G | |
| L-Histadine | Sigma-Aldrich | H8000-25G | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752-25G | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-25G | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L5501-25G | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M9625-25G | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126-100G | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380-100G | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S4500-100G | |
| L-Threonine | Sigma-Aldrich | T8625-25G | |
| L-Tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254-25G | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754-100G | |
| Luria Broth | ThermoFisher | 12795027 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V0500-25G | |
| Mg(Glu)2 | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661-250G | |
| Microfuge 20 | Beckman Coulter | B30134 | |
| Molecular Grade Water | Sigma-Aldrich | 7732-18-5 | |
| NaCl | Alfa Aesar | A12313 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N8535-15VL | |
| New Brunswick Innova 42/42R Incubator | Eppendorf | M1335-0000 | |
| NH4(Glu) | Sigma-Aldrich | 09689-250G | |
| NTPs | ThermoFisher | R0481 | |
| Oxalic Acid | Sigma-Aldrich | P0963-100G | |
| PEP | Sigma-Aldrich | 860077-250MG | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Acros, Organics | A0382124 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Acros, Organics | A0379904 | |
| PureLink HiPure Plasmid Prep Kit | ThermoFisher | K210007 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | D13208-25G | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266-5G | |
| Tris(OAc) | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| Tryptone | Fisher Bioreagents | 73049-73-7 | |
| Tunair 2.5L Baffled Shake Flask | Sigma-Aldrich | Z710822 | |
| Ultrasonic Processor | QSonica | Q125-230V/50HZ | |
| Yeast Extract | Fisher Bioreagents | 1/2/8013 |
Riferimenti
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user’s guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), (2020).
- Swartz, J. R. Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview. Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).
- Jared, B., Dopp, L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract. Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2019).
- Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).
- Calhoun, K. A., Swartz, J. R. Energizing cell-free protein synthesis with glucose metabolism. Biotechnology and Bioengineering. 90 (5), 606-613 (2005).
- Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. Journal of Visualized Experiments. (144), e58882 (2019).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression. System for Synthetic Biology. , 1-14 (2013).
- Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167, 248-254 (2016).
- Moore, S. J., Macdonald, J. T., Freemont, P. S. Cell-free synthetic biology for in vitro prototype engineering. Biochemical Society Transactions. 45 (3), 785-791 (2017).
- Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
- Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
- Dopp, J. L., Reuel, N. F. Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis. Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).
- Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663 (2015).
- Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).
- Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. Cell-free protein synthesis: Pros and cons of prokaryotic and eukaryotic systems. ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).
- Laohakunakorn, N., Grasemann, L., Lavickova, B., Michielin, G. Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).
- Ahn, J. H., et al. Cell-free synthesis of recombinant proteins from PCR-amplified genes at a comparable productivity to that of plasmid-based reactions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 338 (3), 1346-1352 (2005).
- Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
- Hunt, J. P., et al. Streamlining the preparation of “endotoxin-free” ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).
- Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).
- Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
- Bosdriesz, E., Molenaar, D., Teusink, B., Bruggeman, F. J. How fast-growing bacteria robustly tune their ribosome concentration to approximate growth-rate maximization. FEBS Journal. 282 (10), 2029-2044 (2015).
- Zawada, J., Swartz, J. Maintaining rapid growth in moderate-density Escherichia coli fermentations. Biotechnology and Bioengineering. 89 (4), 407-415 (2005).
- Kim, J., Copeland, C. E., Padumane, S. R., Kwon, Y. C. A crude extract preparation and optimization from a genomically engineered Escherichia coli for the cell-free protein synthesis system: Practical laboratory guideline. Methods and Protocols. 2 (3), 1-15 (2019).
- Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli. Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).
- Levine, M. Z., et al. Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-h workflow for cell-free expression. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).
- Martin, R. W., et al. Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids. Nature Communications. , 1-9 (2018).
- Soye, B. J. D., et al. Resource A highly productive, One-pot cell-free protein synthesis platform based on genomically recoded Escherichia coli resource. Cell Chemical Biology. 26 (12), 1743-1754 (2019).
- Ezure, T., Suzuki, T., Ando, E. A cell-free protein synthesis system from insect cells. Methods in Molecular Biology. , 285-296 (2014).
- Heide, C., et al. development and optimization of a functional mammalian cell-free protein synthesis platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1-10 (2021).
