Von der Zelle zur zellfreien Proteinsynthese innerhalb von 24 Stunden mit zellfreiem Autoinduktions-Workflow
Summary
Diese Arbeit beschreibt die Herstellung von Zellextrakt aus Escherichia coli (E. coli ) gefolgt von zellfreien Proteinsynthesereaktionen (CFPS) in weniger als 24 Stunden. Die Erläuterung des CFAI-Protokolls (Cell-Free Autoinduction) beschreibt Verbesserungen, die vorgenommen wurden, um die Aufsicht der Forscher zu reduzieren und die Mengen des erhaltenen Zellextrakts zu erhöhen.
Abstract
Die zellfreie Proteinsynthese (CFPS) hat sich zu einer biotechnologischen Plattform entwickelt, die Transkriptions- und Translationsmaschinen in vitro erfasst. Zahlreiche Entwicklungen haben die CFPS-Plattform für neue Anwender zugänglicher gemacht und das Anwendungsspektrum erweitert. Für lysatbasierte CFPS-Systeme können Zellextrakte aus einer Vielzahl von Organismen erzeugt werden, wobei die einzigartige Biochemie dieses Wirts genutzt wird, um die Proteinsynthese zu verstärken. In den letzten 20 Jahren hat sich Escherichia coli (E. coli) aufgrund seiner Erschwinglichkeit und Vielseitigkeit zu einem der am häufigsten verwendeten Organismen zur Unterstützung von CFPS entwickelt. Trotz zahlreicher wichtiger Fortschritte ist der Workflow für die Herstellung von E. coli-Zellextrakten nach wie vor ein wichtiger Engpass für neue Anwender bei der Implementierung von CFPS für ihre Anwendungen . Der Workflow der Extraktaufbereitung ist zeitintensiv und erfordert technisches Know-how, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Um diese Barrieren zu überwinden, haben wir bereits über die Entwicklung eines 24-Stunden-CFAI-Workflows (Cell-Free Autoinduction) berichtet, der den Benutzeraufwand und das erforderliche technische Fachwissen reduziert. Der CFAI-Workflow minimiert den Arbeitsaufwand und die technischen Fähigkeiten, die für die Erzeugung von Zellextrakten erforderlich sind, und erhöht gleichzeitig die Gesamtmenge der erhaltenen Zellextrakte. Hier beschreiben wir diesen Workflow Schritt für Schritt, um den Zugang zu verbessern und die breite Implementierung von E. coli-basiertem CFPS zu unterstützen.
Introduction
Der Einsatz der zellfreien Proteinsynthese (CFPS) für biotechnologische Anwendungen hat in den letzten Jahren erheblich zugenommen 1,2,3. Diese Entwicklung ist zum Teil auf verstärkte Anstrengungen zum Verständnis der in CFPS auftretenden Prozesse und der Rolle jeder Komponentezurückzuführen 4,5. Darüber hinaus haben reduzierte Kosten, die auf optimierte Setups und alternative Energiequellen zurückzuführen sind, die Implementierung der zellfreien Technologie für neue Benutzer erleichtert 6,7,8,9. Um die notwendigen Transkriptions- und Translationsfaktoren für die Proteinsynthese zu implementieren, wird Zellextrakt häufig verwendet, um zellfreie Reaktionen anzutreiben10. Kürzlich veröffentlichte Benutzerhandbücher haben einfache Protokolle für die Erstellung von Funktionsextrakten bereitgestellt, die die Implementierung für neue und erfahreneBenutzer erleichtern 1,11,12,13,14. Zellextrakt wird normalerweise durch die Lyse einer Zellkultur gewonnen, die je nach gewünschter spezifischer Verwendung mit verschiedenen Organismen gezüchtet werden kann 1,15,16.
Escherichia coli (E. coli) hat sich schnell zu einem der am häufigsten verwendeten Wirtsorganismen für die Herstellung funktioneller Extrakteentwickelt 17. Der Stamm BL21 Star (DE3) wird bevorzugt, da er die Proteasen von der äußeren Membran (OmpT-Protease) und dem Zytoplasma (Lon-Protease) entfernt und eine optimale Umgebung für die rekombinante Proteinexpression bietet. Darüber hinaus enthält das DE3 das λDE3, das das Gen für die T7-RNA-Polymerase (T7-RNAP) unter der Kontrolle des lacUV5-Promotors trägt; Die Sternkomponente enthält ein mutiertes RNaseE-Gen, das die Spaltung der mRNA 4,14,18,19 verhindert. Unter dem lacUV5-Promotor ermöglicht die Induktion von Isopropyl-Thiogalactopyranosid (IPTG) die Expression von T7-RNAP20,21. Diese Stämme werden verwendet, um Zellen zu züchten und zu ernten, die Rohstoffe für die Extraktherstellung liefern. Die Zelllyse kann mit einer Vielzahl von Methoden durchgeführt werden, einschließlich Perlenschlagen, French Press, Homogenisierung, Beschallung und Stickstoffkavitation 1,11,12,22.
Der Prozess der Bakterienkultur und -ernte ist bei der Verwendung von E. coli auf den meisten Plattformen konsistent, erfordert jedoch mehrere Tage und eine intensive Aufsicht durch die Forscher 1,11,13. Dieser Prozess beginnt im Allgemeinen mit einer Samenkultur über Nacht in LB-Brühe, die dann bei Wachstum über Nacht am nächsten Tag in eine größere Kultur von 2xYTPG (Hefe, Trypton, Phosphatpuffer, Glukose) eingeimpft wird. Das Wachstum dieser größeren Kultur wird überwacht, bis sie die frühe bis mittlere Log-Phase mit einer optischen Dichte (OD) von 2,514,20 erreicht. Eine konstante Messung ist erforderlich, da sich die Komponenten der Transkription und Translation bereits in der frühen bis mittleren Log-Phase23,24 als hochaktiv erwiesen haben. Während dieser Prozess reproduzierbaren Extrakt erzeugen kann, hat unser Labor kürzlich eine neue Methode mit Cell-Free Autoinduction (CFAI) Media entwickelt, die die Aufsicht der Forscher reduziert, die Gesamtausbeute an Extrakt für einen bestimmten Liter Zellkultur erhöht und den Zugang zu E. coli-basierter Extraktvorbereitung für erfahrene und neue Benutzer verbessert (Abbildung 1 ). Hier bieten wir die Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Implementierung des CFAI-Workflows, um innerhalb von 24 Stunden von einer gestreiften Zellplatte zu einer abgeschlossenen CFPS-Reaktion zu gelangen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Aufsicht der Forscher wird traditionell für zwei Schlüsselaktionen während des Zellwachstums benötigt: die Induktion von T7-RNAP und die Gewinnung von Zellen bei einem spezifischen OD600. CFAI macht beide Anforderungen überflüssig, um die Zeit des Forschers und die technische Ausbildung zu verringern, die für die Herstellung hochwertiger Zellextrakte erforderlich sind. Die Autoinduktion von T7-RNAP wird erreicht, indem Glukose durch Laktose als primären Zucker in den Medien ersetzt wird, wodurch di…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Jennifer VanderKelen und Andrea Laubscher für die technische Unterstützung. Die Autoren danken auch Nicole Gregorio, Max Levine, Alissa Mullin, Byungcheol So, August Brookwell, Elizabeth (Lizzy) Vojvoda, Logan Burrington und Jillian Kasman für hilfreiche Diskussionen. Die Autoren würdigen auch die finanzielle Unterstützung durch den Bill and Linda Frost Fund, den Chevron Biotechnology Applied Research Endowment Grant des Center for Applications in Biotechnology, Cal Poly Research, Scholarly und die National Science Foundation (NSF-1708919).
Materials
| 1.5 mL Microfuge Tubes | Phenix | MPC-425Q | |
| 1L Centrifuge Tube | Beckman Coulter | A99028 | |
| Avanti J-E Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C3144-25MG | |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT5F | |
| D-Glucose | Fisher | D16-3 | |
| D-Lactose | Alfa Aesar | J66376 | |
| DTT | ThermoFisher | 15508013 | |
| Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-100G | |
| HEPES | ThermoFisher | 11344041 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| JLA-8.1000 Rotor | Beckman Coulter | 366754 | |
| K(Glu) | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| K(OAc) | Sigma-Aldrich | P1190-1KG | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P5958-500G | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A7627-100G | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A8094-25G | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A0884-25G | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A7219-100G | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352-25G | |
| L-Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126-250G | |
| L-Histadine | Sigma-Aldrich | H8000-25G | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752-25G | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-25G | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L5501-25G | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M9625-25G | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126-100G | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380-100G | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S4500-100G | |
| L-Threonine | Sigma-Aldrich | T8625-25G | |
| L-Tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254-25G | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754-100G | |
| Luria Broth | ThermoFisher | 12795027 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V0500-25G | |
| Mg(Glu)2 | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661-250G | |
| Microfuge 20 | Beckman Coulter | B30134 | |
| Molecular Grade Water | Sigma-Aldrich | 7732-18-5 | |
| NaCl | Alfa Aesar | A12313 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N8535-15VL | |
| New Brunswick Innova 42/42R Incubator | Eppendorf | M1335-0000 | |
| NH4(Glu) | Sigma-Aldrich | 09689-250G | |
| NTPs | ThermoFisher | R0481 | |
| Oxalic Acid | Sigma-Aldrich | P0963-100G | |
| PEP | Sigma-Aldrich | 860077-250MG | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Acros, Organics | A0382124 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Acros, Organics | A0379904 | |
| PureLink HiPure Plasmid Prep Kit | ThermoFisher | K210007 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | D13208-25G | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266-5G | |
| Tris(OAc) | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| Tryptone | Fisher Bioreagents | 73049-73-7 | |
| Tunair 2.5L Baffled Shake Flask | Sigma-Aldrich | Z710822 | |
| Ultrasonic Processor | QSonica | Q125-230V/50HZ | |
| Yeast Extract | Fisher Bioreagents | 1/2/8013 |
Riferimenti
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