От клеток к бесклеточному синтезу белка в течение 24 часов с помощью бесклеточного процесса автоиндукции
Summary
В этой работе описывается получение клеточного экстракта из кишечной палочки (E. coli) с последующими реакциями бесклеточного синтеза белка (CFPS) менее чем за 24 часа. Объяснение протокола бесклеточной аутоиндукции (CFAI) детализирует улучшения, сделанные для уменьшения надзора исследователей и увеличения количества получаемого клеточного экстракта.
Abstract
Бесклеточный синтез белка (CFPS) вырос как биотехнологическая платформа, которая захватывает механизмы транскрипции и трансляции in vitro. Многочисленные разработки сделали платформу CFPS более доступной для новых пользователей и расширили спектр приложений. Для систем CFPS на основе лизата клеточные экстракты могут быть получены из различных организмов, используя уникальную биохимию этого хозяина для увеличения синтеза белка. За последние 20 лет Escherichia coli (E. coli) стала одним из наиболее широко используемых организмов для поддержки CFPS из-за его доступности и универсальности. Несмотря на многочисленные ключевые достижения, рабочий процесс подготовки экстракта клеток E. coli остается ключевым узким местом для новых пользователей, чтобы внедрить CFPS для своих применений. Процесс подготовки выписки занимает много времени и требует технических знаний для достижения воспроизводимых результатов. Чтобы преодолеть эти барьеры, мы ранее сообщали о разработке 24-часового рабочего процесса автоиндукции без клеток (CFAI), который снижает пользовательский вклад и требуемые технические знания. Рабочий процесс CFAI сводит к минимуму трудозатраты и технические навыки, необходимые для создания клеточных экстрактов, а также увеличивает общее количество полученных клеточных экстрактов. Здесь мы пошагово описываем этот рабочий процесс для улучшения доступа и поддержки широкого внедрения CFPS на основе E. coli .
Introduction
Использование бесклеточного синтеза белка (CFPS) для применения в биотехнологии значительно выросло за последние несколько летна 1,2,3. Это развитие можно отчасти объяснить активизацией усилий по пониманию процессов, происходящих в ХФПС, и роли каждого компонента 4,5. Кроме того, снижение затрат, связанных с оптимизированными установками и альтернативными источниками энергии, облегчило внедрение бесклеточной технологии для новых пользователей 6,7,8,9. Чтобы реализовать необходимые факторы транскрипции и трансляции для синтеза белка, клеточный экстракт часто используется для управления бесклеточными реакциями10. Недавно опубликованные руководства пользователя предоставили простые протоколы для создания функционального извлечения, что облегчает его реализацию для новых и опытных пользователей, как 1,11,12,13,14. Клеточный экстракт обычно получают путем лизиса клеточной культуры, которая может быть выращена с использованием различных организмов в зависимости от желаемого конкретного использования 1,15,16.
Кишечная палочка (E. coli) быстро стала одним из наиболее часто используемых организмов-хозяев для производства функциональных экстрактов17. Штамм BL21 Star (DE3) является предпочтительным, поскольку он удаляет протеазы из внешней мембраны (протеаза OmpT) и цитоплазму (протеаза Lon), обеспечивая оптимальную среду для экспрессии рекомбинантного белка. Кроме того, DE3 содержит λDE3, который несет ген T7 РНК-полимеразы (T7 RNAP) под контролем промотора lacUV5; звездный компонент содержит мутировавший ген RNaseE, который предотвращает расщепление мРНК 4,14,18,19. Под действием промотора lacUV5 индукция изопропил-тиогалактопиранозида (IPTG) позволяет экспрессировать T7 RNAP20,21. Эти штаммы используются для выращивания и сбора клеток, которые дают сырье для приготовления экстракта. Лизис клеток может быть выполнен с использованием различных методов, включая биение шариков, френч-пресс, гомогенизацию, обработку ультразвуком и кавитацию азота 1,11,12,22.
Процесс культивирования и сбора бактерий согласован на большинстве платформ при использовании кишечной палочки, но требует нескольких дней и интенсивного надзора исследователей 1,11,13. Этот процесс обычно начинается с ночной посевной культуры в бульоне LB, которая после ночного роста затем инокулируется в более крупную культуру 2xYTPG (дрожжи, триптон, фосфатный буфер, глюкоза) на следующий день. Рост этой более крупной культуры контролируется до тех пор, пока она не достигнет ранней и средней фазы log, при оптической плотности (OD) 2,514,20. Постоянное измерение требуется, поскольку компоненты транскрипции и перевода ранее были продемонстрированы как очень активные в начале-середине фазылогарифма 23,24. Хотя этот процесс может создать воспроизводимый экстракт, наша лаборатория недавно разработала новый метод с использованием бесклеточной автоиндукционной среды (CFAI), который уменьшает надзор исследователей, увеличивает общий выход экстракта для данного литра клеточной культуры и улучшает доступ к препарату экстракта на основе кишечной палочки как для опытных, так и для новых пользователей (рисунок 1). ). Здесь мы предоставляем пошаговое руководство по реализации рабочего процесса CFAI, чтобы перейти от полосатой пластины клеток к завершенной реакции CFPS в течение 24 часов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Надзор исследователей традиционно необходим для двух ключевых действий во время роста клеток: индукции T7 RNAP и сбора клеток при определенном OD600. CFAI устраняет оба этих требования, чтобы сократить время исследователя и техническую подготовку, необходимую для приготовления высокок…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить доктора Дженнифер ВандерКелен и Андреа Лаубшер за техническую поддержку. Авторы также хотели бы поблагодарить Николь Грегорио, Макса Левина, Алиссу Маллин, Бюнгчеола Со, Августа Бруквелла, Элизабет (Лиззи) Воеводу, Логана Беррингтона и Джиллиан Касман за полезные обсуждения. Авторы также признают финансовую поддержку со стороны Фонда Билла и Линды Фрост, Центра приложений в биотехнологии Chevron Biotechnology Applied Research Endowment Grant, Cal Poly Research, Scholarly и Национального научного фонда (NSF-1708919).
Materials
| 1.5 mL Microfuge Tubes | Phenix | MPC-425Q | |
| 1L Centrifuge Tube | Beckman Coulter | A99028 | |
| Avanti J-E Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C3144-25MG | |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT5F | |
| D-Glucose | Fisher | D16-3 | |
| D-Lactose | Alfa Aesar | J66376 | |
| DTT | ThermoFisher | 15508013 | |
| Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-100G | |
| HEPES | ThermoFisher | 11344041 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| JLA-8.1000 Rotor | Beckman Coulter | 366754 | |
| K(Glu) | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| K(OAc) | Sigma-Aldrich | P1190-1KG | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P5958-500G | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A7627-100G | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A8094-25G | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A0884-25G | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A7219-100G | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352-25G | |
| L-Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126-250G | |
| L-Histadine | Sigma-Aldrich | H8000-25G | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752-25G | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-25G | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L5501-25G | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M9625-25G | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126-100G | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380-100G | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S4500-100G | |
| L-Threonine | Sigma-Aldrich | T8625-25G | |
| L-Tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254-25G | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754-100G | |
| Luria Broth | ThermoFisher | 12795027 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V0500-25G | |
| Mg(Glu)2 | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661-250G | |
| Microfuge 20 | Beckman Coulter | B30134 | |
| Molecular Grade Water | Sigma-Aldrich | 7732-18-5 | |
| NaCl | Alfa Aesar | A12313 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N8535-15VL | |
| New Brunswick Innova 42/42R Incubator | Eppendorf | M1335-0000 | |
| NH4(Glu) | Sigma-Aldrich | 09689-250G | |
| NTPs | ThermoFisher | R0481 | |
| Oxalic Acid | Sigma-Aldrich | P0963-100G | |
| PEP | Sigma-Aldrich | 860077-250MG | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Acros, Organics | A0382124 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Acros, Organics | A0379904 | |
| PureLink HiPure Plasmid Prep Kit | ThermoFisher | K210007 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | D13208-25G | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266-5G | |
| Tris(OAc) | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| Tryptone | Fisher Bioreagents | 73049-73-7 | |
| Tunair 2.5L Baffled Shake Flask | Sigma-Aldrich | Z710822 | |
| Ultrasonic Processor | QSonica | Q125-230V/50HZ | |
| Yeast Extract | Fisher Bioreagents | 1/2/8013 |
Riferimenti
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user’s guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), (2020).
- Swartz, J. R. Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview. Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).
- Jared, B., Dopp, L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract. Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2019).
- Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).
- Calhoun, K. A., Swartz, J. R. Energizing cell-free protein synthesis with glucose metabolism. Biotechnology and Bioengineering. 90 (5), 606-613 (2005).
- Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. Journal of Visualized Experiments. (144), e58882 (2019).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression. System for Synthetic Biology. , 1-14 (2013).
- Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167, 248-254 (2016).
- Moore, S. J., Macdonald, J. T., Freemont, P. S. Cell-free synthetic biology for in vitro prototype engineering. Biochemical Society Transactions. 45 (3), 785-791 (2017).
- Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
- Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
- Dopp, J. L., Reuel, N. F. Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis. Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).
- Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663 (2015).
- Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).
- Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. Cell-free protein synthesis: Pros and cons of prokaryotic and eukaryotic systems. ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).
- Laohakunakorn, N., Grasemann, L., Lavickova, B., Michielin, G. Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).
- Ahn, J. H., et al. Cell-free synthesis of recombinant proteins from PCR-amplified genes at a comparable productivity to that of plasmid-based reactions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 338 (3), 1346-1352 (2005).
- Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
- Hunt, J. P., et al. Streamlining the preparation of “endotoxin-free” ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).
- Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).
- Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
- Bosdriesz, E., Molenaar, D., Teusink, B., Bruggeman, F. J. How fast-growing bacteria robustly tune their ribosome concentration to approximate growth-rate maximization. FEBS Journal. 282 (10), 2029-2044 (2015).
- Zawada, J., Swartz, J. Maintaining rapid growth in moderate-density Escherichia coli fermentations. Biotechnology and Bioengineering. 89 (4), 407-415 (2005).
- Kim, J., Copeland, C. E., Padumane, S. R., Kwon, Y. C. A crude extract preparation and optimization from a genomically engineered Escherichia coli for the cell-free protein synthesis system: Practical laboratory guideline. Methods and Protocols. 2 (3), 1-15 (2019).
- Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli. Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).
- Levine, M. Z., et al. Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-h workflow for cell-free expression. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).
- Martin, R. W., et al. Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids. Nature Communications. , 1-9 (2018).
- Soye, B. J. D., et al. Resource A highly productive, One-pot cell-free protein synthesis platform based on genomically recoded Escherichia coli resource. Cell Chemical Biology. 26 (12), 1743-1754 (2019).
- Ezure, T., Suzuki, T., Ando, E. A cell-free protein synthesis system from insect cells. Methods in Molecular Biology. , 285-296 (2014).
- Heide, C., et al. development and optimization of a functional mammalian cell-free protein synthesis platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1-10 (2021).
