עבודה זו מתארת את הכנת תמצית התאים מ-Escherichia coli (E. coli) ולאחר מכן תגובות של סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) תוך פחות מ-24 שעות. הסבר על פרוטוקול אוטו-אינדוקציה ללא תאים (CFAI) מפרט שיפורים שנעשו כדי להפחית את הפיקוח על החוקרים ולהגדיל את כמויות תמצית התאים המתקבלות.
סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) גדלה כפלטפורמה ביוטכנולוגית הלוכדת מכונות שעתוק ותרגום במבחנה. התפתחויות רבות הפכו את פלטפורמת CFPS לנגישה יותר למשתמשים חדשים והרחיבו את מגוון היישומים. עבור מערכות CFPS מבוססות ליסאט, ניתן להפיק תמציות תאים ממגוון אורגניזמים, ולרתום את הביוכימיה הייחודית של אותו פונדקאי כדי להגביר את סינתזת החלבונים. במהלך 20 השנים האחרונות, Escherichia coli (E. coli) הפך לאחד האורגניזמים הנפוצים ביותר לתמיכה ב- CFPS בשל יכולתו הכלכלית והרבגוניות שלו. למרות ההתקדמות העיקרית הרבה, זרימת העבודה להכנת תמצית תאי E. coli נותרה צוואר בקבוק מרכזי עבור משתמשים חדשים כדי ליישם CFPS עבור היישומים שלהם. זרימת העבודה של הכנת החילוץ היא עתירת זמן ודורשת מומחיות טכנית כדי להשיג תוצאות הניתנות לשחזור. כדי להתגבר על מחסומים אלה, דיווחנו בעבר על פיתוח של זרימת עבודה של אינדוקציה אוטומטית (CFAI) הפועלת 24 שעות ביממה ללא תאים, המפחיתה את קלט המשתמש ואת המומחיות הטכנית הנדרשת. זרימת העבודה של CFAI ממזערת את העבודה ואת המיומנות הטכנית הנדרשת ליצירת תמציות תאים תוך הגדלת הכמויות הכוללות של תמציות תאים המתקבלות. כאן אנו מתארים את זרימת העבודה הזו באופן שלב אחר שלב כדי לשפר את הגישה ולתמוך ביישום הרחב של CFPS מבוסס E. coli .
השימוש בסינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) ליישומי ביוטכנולוגיה גדל משמעותית בשנים האחרונות 1,2,3. ניתן לייחס התפתחות זו בחלקה למאמצים מוגברים בהבנת התהליכים המתרחשים ב- CFPS ובתפקידו של כל רכיב 4,5. בנוסף, עלויות מופחתות המיוחסות לתפאורות ממוטבות ולמקורות אנרגיה חלופיים הפכו את הטכנולוגיה נטולת התאים לקלה יותר ליישום עבור משתמשים חדשים 6,7,8,9. על מנת ליישם את גורמי השעתוק והתרגום הדרושים לסינתזת חלבונים, תמצית התא משמשת לעתים קרובות להנעת תגובות ללא תאים10. מדריכי משתמשים שפורסמו לאחרונה סיפקו פרוטוקולים פשוטים להפקת תמצית פונקציונלית, מה שמקל על היישום עבור משתמשים חדשים ומנוסים כאחד 1,11,12,13,14. תמצית תאים מתקבלת בדרך כלל באמצעות תזה של תרבית תאים, אשר ניתן לגדל באמצעות אורגניזמים שונים בהתאם לשימוש הספציפי הרצוי 1,15,16.
Escherichia coli (E. coli) הפך במהירות לאחד האורגניזמים המארחים הנפוצים ביותר לייצור תמציות פונקציונליות17. זן BL21 Star (DE3) מועדף מכיוון שהוא מסיר את הפרוטאזות מהממברנה החיצונית (OmpT פרוטאז) והציטופלסמה (Lon protease), ומספק סביבה אופטימלית לביטוי החלבון הרקומביננטי. בנוסף, ה-DE3 מכיל את ה-λDE3 שנושא את הגן עבור T7 RNA פולימראז (T7 RNAP) תחת שליטתו של מקדם ה-lacUV5; רכיב הכוכב מכיל גן RNaseE שעבר מוטציה המונע ביקוע של mRNA 4,14,18,19. תחת מקדם lacUV5, אינדוקציה של איזופרופיל-תיוגלאקטופירנוזיד (IPTG) מאפשרת ביטוי של T7 RNAP20,21. זנים אלה משמשים לגידול וקציר תאים, אשר נותנים חומר גלם להכנת תמצית. ניתן לבצע ליזיס של תאים במגוון שיטות, כולל הכאת חרוזים, עיתונות צרפתית, הומוגניזציה, סוניקציה וקוויטציה של חנקן 1,11,12,22.
תהליך תרביות החיידקים והקציר עקבי ברוב הפלטפורמות בעת שימוש ב-E. coli, אך דורש מספר ימים ופיקוח אינטנסיבי של החוקריםעל 1,11,13. תהליך זה מתחיל בדרך כלל בתרבית זרעי לילה במרק LB, אשר עם צמיחת הלילה מחוסנת לתרבית גדולה יותר של 2xYTPG (שמרים, טריפטון, מאגר פוספטים, גלוקוז) למחרת. הצמיחה של תרבית גדולה יותר זו מנוטרת עד שהיא מגיעה לשלב הלוג המוקדם עד אמצע, בצפיפות אופטית (OD) של 2.514,20. נדרשת מדידה מתמדת מכיוון שמרכיבי התעתיק והתרגום הוכחו בעבר כפעילים מאוד בשלב הלוג המוקדם עד אמצע23,24. בעוד שתהליך זה יכול ליצור תמצית הניתנת לשחזור, המעבדה שלנו פיתחה לאחרונה שיטה חדשה באמצעות מדיה אוטו-אינדוקציה ללא תאים (CFAI), אשר מפחיתה את הפיקוח על החוקרים, מגדילה את התפוקה הכוללת של תמצית עבור ליטר נתון של תרבית תאים, ומשפרת את הגישה להכנת תמצית מבוססת E. coli עבור משתמשים מנוסים וחדשים כאחד (איור 1 ). כאן אנו מספקים את המדריך שלב אחר שלב ליישום זרימת העבודה של CFAI, כדי לעבור מלוח תאים מפוספס לתגובת CFPS שהושלמה תוך 24 שעות.
פיקוח על חוקרים נחוץ באופן מסורתי לשתי פעולות מפתח במהלך גדילת התאים: אינדוקציה של T7 RNAP ותאי קצירת תאים ב-OD600 ספציפי. CFAI מייתר את שתי הדרישות הללו כדי להפחית את הזמן וההכשרה הטכנית הנדרשת לחוקר על מנת להכין תמציות תאים באיכות גבוהה. אינדוקציה אוטומטית של T7 RNAP מושגת על ידי החלפת גלוקוז …
The authors have nothing to disclose.
המחברים מבקשים להודות לד”ר ג’ניפר ונדרקלן ולאנדראה לובשר על התמיכה הטכנית. המחברים רוצים להודות גם לניקול גרגוריו, מקס לוין, אליסה מולין, ביונגצ’ול סו, אוגוסט ברוקוול, אליזבת (ליזי) וויבודה, לוגן ברינגטון וג’יליאן קסמן על דיונים מועילים. המחברים מכירים גם בתמיכת מימון מקרן ביל ולינדה פרוסט, המרכז ליישומים במענק המחקר היישומי של שברון ביוטכנולוגיה, Cal Poly Research, Scholarly והקרן הלאומית למדע (NSF-1708919).
1.5 mL Microfuge Tubes | Phenix | MPC-425Q | |
1L Centrifuge Tube | Beckman Coulter | A99028 | |
Avanti J-E Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
CoA | Sigma-Aldrich | C3144-25MG | |
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT5F | |
D-Glucose | Fisher | D16-3 | |
D-Lactose | Alfa Aesar | J66376 | |
DTT | ThermoFisher | 15508013 | |
Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-100G | |
HEPES | ThermoFisher | 11344041 | |
IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
JLA-8.1000 Rotor | Beckman Coulter | 366754 | |
K(Glu) | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
K(OAc) | Sigma-Aldrich | P1190-1KG | |
KOH | Sigma-Aldrich | P5958-500G | |
L-Alanine | Sigma-Aldrich | A7627-100G | |
L-Arginine | Sigma-Aldrich | A8094-25G | |
L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A0884-25G | |
L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A7219-100G | |
L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352-25G | |
L-Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126-250G | |
L-Histadine | Sigma-Aldrich | H8000-25G | |
L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752-25G | |
L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-25G | |
L-Lysine | Sigma-Aldrich | L5501-25G | |
L-Methionine | Sigma-Aldrich | M9625-25G | |
L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126-100G | |
L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380-100G | |
L-Serine | Sigma-Aldrich | S4500-100G | |
L-Threonine | Sigma-Aldrich | T8625-25G | |
L-Tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254-25G | |
L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754-100G | |
Luria Broth | ThermoFisher | 12795027 | |
L-Valine | Sigma-Aldrich | V0500-25G | |
Mg(Glu)2 | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661-250G | |
Microfuge 20 | Beckman Coulter | B30134 | |
Molecular Grade Water | Sigma-Aldrich | 7732-18-5 | |
NaCl | Alfa Aesar | A12313 | |
NAD | Sigma-Aldrich | N8535-15VL | |
New Brunswick Innova 42/42R Incubator | Eppendorf | M1335-0000 | |
NH4(Glu) | Sigma-Aldrich | 09689-250G | |
NTPs | ThermoFisher | R0481 | |
Oxalic Acid | Sigma-Aldrich | P0963-100G | |
PEP | Sigma-Aldrich | 860077-250MG | |
Potassium Phosphate Dibasic | Acros, Organics | A0382124 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Acros, Organics | A0379904 | |
PureLink HiPure Plasmid Prep Kit | ThermoFisher | K210007 | |
Putrescine | Sigma-Aldrich | D13208-25G | |
Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266-5G | |
Tris(OAc) | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
Tryptone | Fisher Bioreagents | 73049-73-7 | |
Tunair 2.5L Baffled Shake Flask | Sigma-Aldrich | Z710822 | |
Ultrasonic Processor | QSonica | Q125-230V/50HZ | |
Yeast Extract | Fisher Bioreagents | 1/2/8013 |