सेल मुक्त ऑटोइंडक्शन वर्कफ़्लो का उपयोग कर 24 घंटे के भीतर सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण के लिए कोशिकाओं से
Summary
यह काम एस्चेरिचिया कोलाई (ई कोलाई) से सेल निकालने की तैयारी का वर्णन करता है, इसके बाद 24 घंटे से कम समय में सेल-फ्री प्रोटीन संश्लेषण (सीएफपीएस) प्रतिक्रियाएं होती हैं। सेल मुक्त ऑटोइंडक्शन (सीएफएआई) प्रोटोकॉल का स्पष्टीकरण शोधकर्ता निरीक्षण को कम करने और प्राप्त सेल निकालने की मात्रा में वृद्धि करने के लिए किए गए सुधारों का विवरण देता है।
Abstract
सेल-फ्री प्रोटीन संश्लेषण (सीएफपीएस) एक जैव प्रौद्योगिकी मंच के रूप में विकसित हुआ है जो इन विट्रो में प्रतिलेखन और अनुवाद मशीनरी को कैप्चर करता है। कई विकासों ने सीएफपीएस प्लेटफॉर्म को नए उपयोगकर्ताओं के लिए अधिक सुलभ बना दिया है और अनुप्रयोगों की सीमा का विस्तार किया है। लाइसेट आधारित सीएफपीएस सिस्टम के लिए, सेल अर्क को विभिन्न जीवों से उत्पन्न किया जा सकता है, प्रोटीन संश्लेषण को बढ़ाने के लिए उस मेजबान की अद्वितीय जैव रसायन का उपयोग करना। पिछले 20 वर्षों के भीतर, एस्चेरिचिया कोलाई (ई कोलाई) अपनी सामर्थ्य और बहुमुखी प्रतिभा के कारण सीएफपीएस का समर्थन करने के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले जीवों में से एक बन गया है। कई प्रमुख प्रगति के बावजूद, ई कोलाई सेल निकालने की तैयारी के लिए वर्कफ़्लो नए उपयोगकर्ताओं के लिए अपने अनुप्रयोगों के लिए सीएफपीएस को लागू करने के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा बनी हुई है। निकालने की तैयारी वर्कफ़्लो समय-गहन है और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए तकनीकी विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है। इन बाधाओं को दूर करने के लिए, हमने पहले 24 घंटे के सेल-फ्री ऑटोइंडक्शन (सीएफएआई) वर्कफ़्लो के विकास की सूचना दी थी जो उपयोगकर्ता इनपुट और आवश्यक तकनीकी विशेषज्ञता को कम करता है। सीएफएआई वर्कफ़्लो सेल अर्क उत्पन्न करने के लिए आवश्यक श्रम और तकनीकी कौशल को कम करता है जबकि प्राप्त सेल अर्क की कुल मात्रा में भी वृद्धि करता है। यहां हम उस वर्कफ़्लो का वर्णन चरण-दर-चरण तरीके से करते हैं ताकि ई कोलाई आधारित सीएफपीएस के व्यापक कार्यान्वयन तक पहुंच में सुधार और समर्थन किया जा सके।
Introduction
जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों के लिए सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण (सीएफपीएस) का उपयोग पिछले कुछ वर्षों में 1,2,3 में काफी वृद्धि हुई है। इस विकास को सीएफपीएस में होने वाली प्रक्रियाओं और प्रत्येक घटक 4,5 की भूमिका को समझने में बढ़े हुए प्रयासों के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, अनुकूलित सेट-अप और वैकल्पिक ऊर्जा स्रोतों के लिए जिम्मेदार कम लागत ने नए उपयोगकर्ताओं 6,7,8,9 के लिए सेल-मुक्त तकनीक को लागू करना आसान बना दिया है। प्रोटीन संश्लेषण के लिए आवश्यक प्रतिलेखन और अनुवाद कारकों को लागू करने के लिए, सेल निकालने का उपयोग अक्सर सेल-मुक्त प्रतिक्रियाओं10 को चलाने के लिए किया जाता है। हाल ही में प्रकाशित उपयोगकर्ता मार्गदर्शिकाओं ने कार्यात्मक निकालने के उत्पादन के लिए सरल प्रोटोकॉल प्रदान किए हैं, जिससे नए और अनुभवी उपयोगकर्ताओं के लिए समान रूप से 1,11,12,13,14 को लागू करना आसान हो गया है। सेल निकालने को आमतौर पर एक सेल संस्कृति के लाइसिस के माध्यम से प्राप्त किया जाता है, जिसे विशिष्ट उपयोग वांछित 1,15,16 के आधार पर विभिन्नजीवों का उपयोग करके उगाया जा सकता है।
एस्चेरिचिया कोलाई (ई कोलाई) तेजी से कार्यात्मक अर्क17 के उत्पादन के लिए सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले मेजबान जीवों में से एक बन गया है। बीएल 21 स्टार (डीई 3) तनाव को प्राथमिकता दी जाती है क्योंकि यह बाहरी झिल्ली (ओएमपीटी प्रोटीज) और साइटोप्लाज्म (लोन प्रोटीज) से प्रोटीज को हटा देता है, जो पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए एक इष्टतम वातावरण प्रदान करता है। इसके अतिरिक्त, डीई 3 में λDE3 होता है जो लैकयूवी 5 प्रमोटर के नियंत्रण में टी 7 आरएनए पोलीमरेज़ (टी 7 आरएनएपी) के लिए जीन को वहन करता है; स्टार घटक में एक उत्परिवर्तित आरएनएएसईई जीन होता है जो एमआरएनए 4,14,18,19 के दरार को रोकता है। लैकयूवी 5 प्रमोटर के तहत, आइसोप्रोपाइल-थियोगैलेक्टोपाइरानोसाइड (आईपीटीजी) प्रेरण टी 7 आरएनएपी20,21 की अभिव्यक्ति की अनुमति देता है। इन उपभेदों का उपयोग कोशिकाओं को विकसित करने और फसल करने के लिए किया जाता है, जो निकालने की तैयारी के लिए कच्चा माल देते हैं। सेल लिसिस को विभिन्न तरीकों का उपयोग करके किया जा सकता है, जिसमें मनका पिटाई, फ्रांसीसी प्रेस, समरूपता, सोनिकेशन और नाइट्रोजन गुहिकायन 1,11,12,22 शामिल हैं।
ई कोलाई का उपयोग करते समय बैक्टीरियल संस्कृति और कटाई की प्रक्रिया अधिकांश प्लेटफार्मों में सुसंगत है, लेकिन कई दिनों और गहन शोधकर्ता निरीक्षण 1,11,13 की आवश्यकता होती है। यह प्रक्रिया आम तौर पर एलबी शोरबा में रात भर की बीज संस्कृति के साथ शुरू होती है, जो रात भर के विकास पर अगले दिन 2xYTPG (खमीर, ट्रिप्टोन, फॉस्फेट बफर, ग्लूकोज) की एक बड़ी संस्कृति में टीका लगाया जाता है। इस बड़ी संस्कृति के विकास की निगरानी तब तक की जाती है जब तक कि यह 2.514,20 के ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) पर शुरुआती-से-मध्य लॉग चरण तक नहीं पहुंच जाता है। निरंतर माप की आवश्यकता होती है क्योंकि प्रतिलेखन और अनुवाद के घटकों को पहले प्रारंभिक-से-मध्य लॉग चरण23,24 में अत्यधिक सक्रिय होने के लिए प्रदर्शित किया गया है। हालांकि यह प्रक्रिया प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य निकालने का निर्माण कर सकती है, हमारी प्रयोगशाला ने हाल ही में सेल-फ्री ऑटोइंडक्शन (सीएफएआई) मीडिया का उपयोग करके एक नई विधि विकसित की है, जो शोधकर्ता निरीक्षण को कम करती है, सेल संस्कृति के किसी दिए गए लीटर के लिए निकालने की समग्र उपज को बढ़ाती है, और अनुभवी और नए दोनों उपयोगकर्ताओं के लिए ई कोलाई-आधारित निकालने की तैयारी तक पहुंच में सुधार करती है (चित्रा 1) ). यहां हम सीएफएआई वर्कफ़्लो को लागू करने के लिए चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका प्रदान करते हैं, कोशिकाओं की एक लकीर वाली प्लेट से 24 घंटों के भीतर एक पूर्ण सीएफपीएस प्रतिक्रिया में जाने के लिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
शोधकर्ता निरीक्षण पारंपरिक रूप से सेल विकास के दौरान दो प्रमुख कार्यों के लिए आवश्यक है: टी 7 आरएनएपी का प्रेरण और एक विशिष्टआयुध डिपो 600 पर कोशिकाओं की कटाई। सीएफएआई उच्च गुणवत्ता वाले सेल अर्क तैय…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक तकनीकी सहायता के लिए डॉ जेनिफर वेंडरकेलेन और एंड्रिया लॉबशर को स्वीकार करना चाहते हैं। लेखक निकोल ग्रेगोरियो, मैक्स लेविन, एलिसा मुलिन, ब्यूंगचियोल सो, अगस्त ब्रुकवेल, एलिजाबेथ (लिज़ी) वोजवोडा, लोगान बरिंगटन और जिलियन कासमैन को उपयोगी चर्चाओं के लिए भी धन्यवाद देना चाहते हैं। लेखक बिल और लिंडा फ्रॉस्ट फंड, जैव प्रौद्योगिकी के शेवरॉन बायोटेक्नोलॉजी एप्लाइड रिसर्च एंडोमेंट ग्रांट, कैल पॉली रिसर्च, स्कॉलरली और नेशनल साइंस फाउंडेशन (एनएसएफ -1708919) में अनुप्रयोगों के लिए केंद्र से वित्त पोषण समर्थन भी स्वीकार करते हैं।
Materials
| 1.5 mL Microfuge Tubes | Phenix | MPC-425Q | |
| 1L Centrifuge Tube | Beckman Coulter | A99028 | |
| Avanti J-E Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C3144-25MG | |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT5F | |
| D-Glucose | Fisher | D16-3 | |
| D-Lactose | Alfa Aesar | J66376 | |
| DTT | ThermoFisher | 15508013 | |
| Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-100G | |
| HEPES | ThermoFisher | 11344041 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| JLA-8.1000 Rotor | Beckman Coulter | 366754 | |
| K(Glu) | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| K(OAc) | Sigma-Aldrich | P1190-1KG | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P5958-500G | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A7627-100G | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A8094-25G | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A0884-25G | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A7219-100G | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352-25G | |
| L-Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126-250G | |
| L-Histadine | Sigma-Aldrich | H8000-25G | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752-25G | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-25G | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L5501-25G | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M9625-25G | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126-100G | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380-100G | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S4500-100G | |
| L-Threonine | Sigma-Aldrich | T8625-25G | |
| L-Tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254-25G | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754-100G | |
| Luria Broth | ThermoFisher | 12795027 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V0500-25G | |
| Mg(Glu)2 | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661-250G | |
| Microfuge 20 | Beckman Coulter | B30134 | |
| Molecular Grade Water | Sigma-Aldrich | 7732-18-5 | |
| NaCl | Alfa Aesar | A12313 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N8535-15VL | |
| New Brunswick Innova 42/42R Incubator | Eppendorf | M1335-0000 | |
| NH4(Glu) | Sigma-Aldrich | 09689-250G | |
| NTPs | ThermoFisher | R0481 | |
| Oxalic Acid | Sigma-Aldrich | P0963-100G | |
| PEP | Sigma-Aldrich | 860077-250MG | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Acros, Organics | A0382124 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Acros, Organics | A0379904 | |
| PureLink HiPure Plasmid Prep Kit | ThermoFisher | K210007 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | D13208-25G | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266-5G | |
| Tris(OAc) | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| Tryptone | Fisher Bioreagents | 73049-73-7 | |
| Tunair 2.5L Baffled Shake Flask | Sigma-Aldrich | Z710822 | |
| Ultrasonic Processor | QSonica | Q125-230V/50HZ | |
| Yeast Extract | Fisher Bioreagents | 1/2/8013 |
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