Fra celler til cellefri proteinsyntese innen 24 timer ved hjelp av cellefri arbeidsflyt for autoinduksjon
Summary
Dette arbeidet beskriver fremstillingen av celleekstrakt fra Escherichia coli (E. coli) etterfulgt av cellefrie proteinsyntesereaksjoner (CFPS) på under 24 timer. Forklaring av den cellefrie autoinduksjonsprotokollen (CFAI) beskriver forbedringer som er gjort for å redusere forskerens tilsyn og øke mengden celleekstrakt oppnådd.
Abstract
Cellefri proteinsyntese (CFPS) har vokst som en bioteknologisk plattform som fanger transkripsjon og oversettelsesmaskiner in vitro. Mange utviklinger har gjort CFPS-plattformen mer tilgjengelig for nye brukere og har utvidet utvalget av applikasjoner. For lysatebaserte CFPS-systemer kan celleekstrakter genereres fra en rekke organismer, og utnytte den unike biokjemien til den verten for å forsterke proteinsyntesen. I løpet av de siste 20 årene har Escherichia coli (E. coli) blitt en av de mest brukte organismene for å støtte CFPS på grunn av sin overkommelighet og allsidighet. Til tross for mange viktige fremskritt, har arbeidsflyten for E. coli-celleekstraktforberedelse forblitt en nøkkelflaskehals for nye brukere å implementere CFPS for sine applikasjoner. Arbeidsflyten for uttrekksforberedelse er tidkrevende og krever teknisk ekspertise for å oppnå reproduserbare resultater. For å overvinne disse barrierene rapporterte vi tidligere utviklingen av en 24-timers cellefri arbeidsflyt for autoinduksjon (CFAI) som reduserer brukerinndata og teknisk ekspertise som kreves. CFAI-arbeidsflyten minimerer arbeids- og tekniske ferdigheter som kreves for å generere celleekstrakter, samtidig som den øker de totale mengdene celleekstrakter som er oppnådd. Her beskriver vi denne arbeidsflyten trinnvis for å forbedre tilgangen og støtte den brede implementeringen av E. coli-basert CFPS.
Introduction
Bruken av cellefri proteinsyntese (CFPS) for bioteknologiske anvendelser har vokst betydelig de siste årene 1,2,3. Denne utviklingen kan delvis tilskrives økt innsats for å forstå prosessene som skjer i CFPS og rollen til hver komponent 4,5. I tillegg har reduserte kostnader knyttet til optimaliserte oppsett og alternative energikilder gjort cellefri teknologi enklere å implementere for nye brukere 6,7,8,9. For å implementere de nødvendige transkripsjons- og oversettelsesfaktorene for proteinsyntese, brukes celleekstrakt ofte til å drive cellefrie reaksjoner10. Nylig publiserte brukerveiledninger har gitt enkle protokoller for å produsere funksjonell ekstrakt, noe som gjør det enklere å implementere for både nye og erfarne brukere 1,11,12,13,14. Celleekstrakt oppnås vanligvis gjennom lysis av en cellekultur, som kan dyrkes ved hjelp av forskjellige organismer avhengig av ønsket bruk 1,15,16.
Escherichia coli (E. coli) har raskt blitt en av de mest brukte vertsorganismer for å produsere funksjonelle ekstrakter17. BL21 Star (DE3)-stammen foretrekkes fordi den fjerner proteasene fra den ytre membranen (OmpT-protease) og cytoplasma (Lon-protease), noe som gir et optimalt miljø for det rekombinante proteinuttrykket. I tillegg inneholder DE3 λDE3 som bærer genet for T7 RNA polymerase (T7 RNAP) under kontroll av lacUV5-promotoren; stjernekomponenten inneholder et mutert RNaseE-gen som forhindrer spalting av mRNA 4,14,18,19. Under lacUV5-promotoren tillater isopropyl-thiogalactopyranoside (IPTG) induksjon uttrykket av T7 RNAP20,21. Disse stammene brukes til å vokse og høste celler, noe som gir råmateriale til ekstraktpreparat. Cellelys kan utføres ved hjelp av en rekke metoder, inkludert perleslag, fransk presse, homogenisering, sonikering og nitrogenkavitasjon 1,11,12,22.
Prosessen med bakteriekultur og høsting er konsistent på tvers av de fleste plattformer når du bruker E. coli, men krever flere dager og intens forskeroppsyn 1,11,13. Denne prosessen starter vanligvis med en over natten frøkultur i LB buljong, som ved nattvekst deretter inokulert til en større kultur på 2xYTPG (gjær, trypton, fosfatbuffer, glukose) neste dag. Veksten av denne større kulturen overvåkes til den når den tidlige til midtre loggfasen, med en optisk tetthet (OD) på 2,514,20. Konstant måling er nødvendig ettersom komponentene i transkripsjon og oversettelse tidligere har vist seg å være svært aktive i den tidlige til midtre loggfasen23,24. Selv om denne prosessen kan skape reproduserbart ekstrakt, har laboratoriet vårt nylig utviklet en ny metode ved hjelp av Cell-Free Autoinduction (CFAI) Media, som reduserer forskeroppsyn, øker det totale utbyttet av ekstrakt for en gitt liter cellekultur, og forbedrer tilgangen til E. coli-basert ekstraktforberedelse for både erfarne og nye brukere (figur 1 ). Her gir vi den trinnvise veiledningen for implementering av CFAI-arbeidsflyten, for å gå fra en stripet plate med celler til en fullført CFPS-reaksjon innen 24 timer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Forskeroppsyn er tradisjonelt nødvendig for to viktige handlinger under cellevekst: induksjon av T7 RNAP og høsting av celler ved en bestemt OD600. CFAI hindrer begge disse kravene til å redusere forskerens tid og tekniske opplæring som kreves for å forberede celleekstrakter av høy kvalitet. Automatisk induksjon av T7 RNAP oppnås ved å erstatte glukose med laktose som det primære sukkeret i media, noe som hindrer det forrige behovet for å aktivt overvåke veksten og deretter indusere med IPTG på et …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfattere vil gjerne anerkjenne Dr. Jennifer VanderKelen og Andrea Laubscher for teknisk støtte. Forfattere vil også takke Nicole Gregorio, Max Levine, Alissa Mullin, Byungcheol So, August Brookwell, Elizabeth (Lizzy) Vojvoda, Logan Burrington og Jillian Kasman for nyttige diskusjoner. Forfattere anerkjenner også støtte fra Bill and Linda Frost Fund, Center for Applications in Biotechnology’s Chevron Biotechnology Applied Research Endowment Grant, Cal Poly Research, Scholarly og National Science Foundation (NSF-1708919).
Materials
| 1.5 mL Microfuge Tubes | Phenix | MPC-425Q | |
| 1L Centrifuge Tube | Beckman Coulter | A99028 | |
| Avanti J-E Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C3144-25MG | |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT5F | |
| D-Glucose | Fisher | D16-3 | |
| D-Lactose | Alfa Aesar | J66376 | |
| DTT | ThermoFisher | 15508013 | |
| Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-100G | |
| HEPES | ThermoFisher | 11344041 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| JLA-8.1000 Rotor | Beckman Coulter | 366754 | |
| K(Glu) | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| K(OAc) | Sigma-Aldrich | P1190-1KG | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P5958-500G | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A7627-100G | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A8094-25G | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A0884-25G | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A7219-100G | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352-25G | |
| L-Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126-250G | |
| L-Histadine | Sigma-Aldrich | H8000-25G | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752-25G | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-25G | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L5501-25G | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M9625-25G | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126-100G | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380-100G | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S4500-100G | |
| L-Threonine | Sigma-Aldrich | T8625-25G | |
| L-Tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254-25G | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754-100G | |
| Luria Broth | ThermoFisher | 12795027 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V0500-25G | |
| Mg(Glu)2 | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661-250G | |
| Microfuge 20 | Beckman Coulter | B30134 | |
| Molecular Grade Water | Sigma-Aldrich | 7732-18-5 | |
| NaCl | Alfa Aesar | A12313 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N8535-15VL | |
| New Brunswick Innova 42/42R Incubator | Eppendorf | M1335-0000 | |
| NH4(Glu) | Sigma-Aldrich | 09689-250G | |
| NTPs | ThermoFisher | R0481 | |
| Oxalic Acid | Sigma-Aldrich | P0963-100G | |
| PEP | Sigma-Aldrich | 860077-250MG | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Acros, Organics | A0382124 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Acros, Organics | A0379904 | |
| PureLink HiPure Plasmid Prep Kit | ThermoFisher | K210007 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | D13208-25G | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266-5G | |
| Tris(OAc) | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| Tryptone | Fisher Bioreagents | 73049-73-7 | |
| Tunair 2.5L Baffled Shake Flask | Sigma-Aldrich | Z710822 | |
| Ultrasonic Processor | QSonica | Q125-230V/50HZ | |
| Yeast Extract | Fisher Bioreagents | 1/2/8013 |
Riferimenti
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user’s guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), (2020).
- Swartz, J. R. Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview. Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).
- Jared, B., Dopp, L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract. Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2019).
- Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).
- Calhoun, K. A., Swartz, J. R. Energizing cell-free protein synthesis with glucose metabolism. Biotechnology and Bioengineering. 90 (5), 606-613 (2005).
- Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. Journal of Visualized Experiments. (144), e58882 (2019).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression. System for Synthetic Biology. , 1-14 (2013).
- Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167, 248-254 (2016).
- Moore, S. J., Macdonald, J. T., Freemont, P. S. Cell-free synthetic biology for in vitro prototype engineering. Biochemical Society Transactions. 45 (3), 785-791 (2017).
- Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
- Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
- Dopp, J. L., Reuel, N. F. Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis. Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).
- Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663 (2015).
- Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).
- Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. Cell-free protein synthesis: Pros and cons of prokaryotic and eukaryotic systems. ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).
- Laohakunakorn, N., Grasemann, L., Lavickova, B., Michielin, G. Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).
- Ahn, J. H., et al. Cell-free synthesis of recombinant proteins from PCR-amplified genes at a comparable productivity to that of plasmid-based reactions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 338 (3), 1346-1352 (2005).
- Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
- Hunt, J. P., et al. Streamlining the preparation of “endotoxin-free” ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).
- Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).
- Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
- Bosdriesz, E., Molenaar, D., Teusink, B., Bruggeman, F. J. How fast-growing bacteria robustly tune their ribosome concentration to approximate growth-rate maximization. FEBS Journal. 282 (10), 2029-2044 (2015).
- Zawada, J., Swartz, J. Maintaining rapid growth in moderate-density Escherichia coli fermentations. Biotechnology and Bioengineering. 89 (4), 407-415 (2005).
- Kim, J., Copeland, C. E., Padumane, S. R., Kwon, Y. C. A crude extract preparation and optimization from a genomically engineered Escherichia coli for the cell-free protein synthesis system: Practical laboratory guideline. Methods and Protocols. 2 (3), 1-15 (2019).
- Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli. Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).
- Levine, M. Z., et al. Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-h workflow for cell-free expression. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).
- Martin, R. W., et al. Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids. Nature Communications. , 1-9 (2018).
- Soye, B. J. D., et al. Resource A highly productive, One-pot cell-free protein synthesis platform based on genomically recoded Escherichia coli resource. Cell Chemical Biology. 26 (12), 1743-1754 (2019).
- Ezure, T., Suzuki, T., Ando, E. A cell-free protein synthesis system from insect cells. Methods in Molecular Biology. , 285-296 (2014).
- Heide, C., et al. development and optimization of a functional mammalian cell-free protein synthesis platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1-10 (2021).
