Från celler till cellfri proteinsyntes inom 24 timmar med hjälp av cellfritt autoinduktionsarbetsflöde
Summary
Detta arbete beskriver beredningen av cellextrakt från Escherichia coli (E. coli) följt av cellfria proteinsyntesreaktioner (CFPS) på under 24 timmar. Förklaring av det cellfria autoinduktionsprotokollet (CFAI) beskriver förbättringar som gjorts för att minska forskarnas tillsyn och öka mängden erhållet cellextrakt.
Abstract
Cellfri proteinsyntes (CFPS) har vuxit som en bioteknikplattform som fångar transkriptions- och översättningsmaskineri in vitro. Många utvecklingar har gjort CFPS-plattformen mer tillgänglig för nya användare och har utökat utbudet av applikationer. För lysatbaserade CFPS-system kan cellextrakt genereras från en mängd olika organismer, utnyttja värdens unika biokemi för att öka proteinsyntesen. Under de senaste 20 åren har Escherichia coli (E. coli) blivit en av de mest använda organismerna för att stödja CFPS på grund av dess överkomliga priser och mångsidighet. Trots många viktiga framsteg har arbetsflödet för beredning av E. coli-cellextrakt förblivit en viktig flaskhals för nya användare att implementera CFPS för sina applikationer. Arbetsflödet för extraktberedning är tidskrävande och kräver teknisk expertis för att uppnå reproducerbara resultat. För att övervinna dessa hinder rapporterade vi tidigare utvecklingen av ett 24-timmars cellfritt autoinduktionsarbetsflöde (CFAI) som minskar användarinmatning och teknisk expertis som krävs. CFAI-arbetsflödet minimerar det arbete och den tekniska skicklighet som krävs för att generera cellextrakt samtidigt som det ökar de totala mängderna cellextrakt som erhålls. Här beskriver vi det arbetsflödet på ett steg-för-steg-sätt för att förbättra tillgången och stödja det breda genomförandet av E. coli-baserade CFPS.
Introduction
Användningen av cellfri proteinsyntes (CFPS) för biotekniska tillämpningar har ökat avsevärt under de senaste åren 1,2,3. Denna utveckling kan delvis tillskrivas ökade ansträngningar för att förstå de processer som förekommer i CFPS och rollen för varje komponent 4,5. Dessutom har minskade kostnader som tillskrivs optimerade inställningar och alternativa energikällor gjort cellfri teknik enklare att implementera för nya användare 6,7,8,9. För att implementera de nödvändiga transkriptions- och translationsfaktorerna för proteinsyntes används cellextrakt ofta för att driva cellfria reaktioner10. Nyligen publicerade användarhandböcker har tillhandahållit enkla protokoll för att producera funktionellt extrakt, vilket gör det lättare att implementera för både nya och erfarna användare 1,11,12,13,14. Cellextrakt erhålls vanligtvis genom lys av en cellodling, som kan odlas med användning av olika organismer beroende på den specifika användningen som önskas 1,15,16.
Escherichia coli (E. coli) har snabbt blivit en av de vanligaste värdorganismerna för att producera funktionella extrakt17. STAMMEN BL21 Star (DE3) är att föredra eftersom den tar bort proteaserna från det yttre membranet (OmpT-proteas) och cytoplasman (Lon-proteas), vilket ger en optimal miljö för det rekombinanta proteinuttrycket. Dessutom innehåller DE3 λDE3 som bär genen för T7 RNA-polymeras (T7 RNAP) under kontroll av lacUV5-promotorn; stjärnkomponenten innehåller en muterad RNaseE-gen som förhindrar klyvning av mRNA 4,14,18,19. Under lacUV5-promotorn tillåter isopropyl-tiogolaktopyranosid (IPTG) induktion uttrycket av T7 RNAP20,21. Dessa stammar används för att odla och skörda celler, vilket ger råmaterial för extraktberedning. Celllys kan utföras med hjälp av en mängd olika metoder, inklusive pärlslagning, fransk press, homogenisering, ultraljudsbehandling och kvävekavitation 1,11,12,22.
Processen för bakteriekultur och skörd är konsekvent på de flesta plattformar vid användning av E. coli, men kräver flera dagar och intensiv forskarövervakning 1,11,13. Denna process börjar vanligtvis med en frökultur över natten i LB-buljong, som vid nattens tillväxt sedan inokuleras i en större kultur av 2xYTPG (jäst, trypton, fosfatbuffert, glukos) nästa dag. Tillväxten av denna större kultur övervakas tills den når den tidiga till mitten av logfasen, vid en optisk densitet (OD) på 2,514,20. Konstant mätning krävs eftersom komponenterna i transkription och översättning tidigare har visat sig vara mycket aktiva i den tidiga till mellersta logfas23,24. Även om denna process kan skapa reproducerbart extrakt, har vårt laboratorium nyligen utvecklat en ny metod med cellfri autoinduktion (CFAI) Media, vilket minskar forskarnas tillsyn, ökar det totala utbytet av extrakt för en viss liter cellodling och förbättrar tillgången till E. coli-baserad extraktberedning för både erfarna och nya användare (Figur 1 ). Här tillhandahåller vi steg-för-steg-guiden för att implementera CFAI-arbetsflödet, för att gå från en streckad cellplatta till en slutförd CFPS-reaktion inom 24 timmar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Forskarövervakning behövs traditionellt för två nyckelåtgärder under celltillväxt: induktion av T7 RNAP och skörd av celler vid en specifik OD600. CFAI undanröjer båda dessa krav för att minska forskarens tid och tekniska utbildning som krävs för att förbereda högkvalitativa cellextrakt. Automatisk induktion av T7 RNAP uppnås genom att ersätta glukos med laktos som primärsocker i media, vilket undanröjer det tidigare behovet av att aktivt övervaka tillväxten och sedan inducera med IPTG vid…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författare vill tacka Dr Jennifer VanderKelen och Andrea Laubscher för teknisk support. Författarna vill också tacka Nicole Gregorio, Max Levine, Alissa Mullin, Byungcheol So, August Brookwell, Elizabeth (Lizzy) Vojvoda, Logan Burrington och Jillian Kasman för hjälpsamma diskussioner. Författare erkänner också finansieringsstöd från Bill och Linda Frost Fund, Center for Applications in Biotechnology’s Chevron Biotechnology Applied Research Endowment Grant, Cal Poly Research, Scholarly och National Science Foundation (NSF-1708919).
Materials
| 1.5 mL Microfuge Tubes | Phenix | MPC-425Q | |
| 1L Centrifuge Tube | Beckman Coulter | A99028 | |
| Avanti J-E Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C3144-25MG | |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT5F | |
| D-Glucose | Fisher | D16-3 | |
| D-Lactose | Alfa Aesar | J66376 | |
| DTT | ThermoFisher | 15508013 | |
| Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-100G | |
| HEPES | ThermoFisher | 11344041 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| JLA-8.1000 Rotor | Beckman Coulter | 366754 | |
| K(Glu) | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| K(OAc) | Sigma-Aldrich | P1190-1KG | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P5958-500G | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A7627-100G | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A8094-25G | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A0884-25G | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A7219-100G | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352-25G | |
| L-Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126-250G | |
| L-Histadine | Sigma-Aldrich | H8000-25G | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752-25G | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-25G | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L5501-25G | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M9625-25G | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126-100G | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380-100G | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S4500-100G | |
| L-Threonine | Sigma-Aldrich | T8625-25G | |
| L-Tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254-25G | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754-100G | |
| Luria Broth | ThermoFisher | 12795027 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V0500-25G | |
| Mg(Glu)2 | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661-250G | |
| Microfuge 20 | Beckman Coulter | B30134 | |
| Molecular Grade Water | Sigma-Aldrich | 7732-18-5 | |
| NaCl | Alfa Aesar | A12313 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N8535-15VL | |
| New Brunswick Innova 42/42R Incubator | Eppendorf | M1335-0000 | |
| NH4(Glu) | Sigma-Aldrich | 09689-250G | |
| NTPs | ThermoFisher | R0481 | |
| Oxalic Acid | Sigma-Aldrich | P0963-100G | |
| PEP | Sigma-Aldrich | 860077-250MG | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Acros, Organics | A0382124 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Acros, Organics | A0379904 | |
| PureLink HiPure Plasmid Prep Kit | ThermoFisher | K210007 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | D13208-25G | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266-5G | |
| Tris(OAc) | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| Tryptone | Fisher Bioreagents | 73049-73-7 | |
| Tunair 2.5L Baffled Shake Flask | Sigma-Aldrich | Z710822 | |
| Ultrasonic Processor | QSonica | Q125-230V/50HZ | |
| Yeast Extract | Fisher Bioreagents | 1/2/8013 |
Riferimenti
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user’s guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), (2020).
- Swartz, J. R. Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview. Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).
- Jared, B., Dopp, L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract. Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2019).
- Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).
- Calhoun, K. A., Swartz, J. R. Energizing cell-free protein synthesis with glucose metabolism. Biotechnology and Bioengineering. 90 (5), 606-613 (2005).
- Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. Journal of Visualized Experiments. (144), e58882 (2019).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression. System for Synthetic Biology. , 1-14 (2013).
- Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167, 248-254 (2016).
- Moore, S. J., Macdonald, J. T., Freemont, P. S. Cell-free synthetic biology for in vitro prototype engineering. Biochemical Society Transactions. 45 (3), 785-791 (2017).
- Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
- Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
- Dopp, J. L., Reuel, N. F. Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis. Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).
- Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663 (2015).
- Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).
- Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. Cell-free protein synthesis: Pros and cons of prokaryotic and eukaryotic systems. ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).
- Laohakunakorn, N., Grasemann, L., Lavickova, B., Michielin, G. Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).
- Ahn, J. H., et al. Cell-free synthesis of recombinant proteins from PCR-amplified genes at a comparable productivity to that of plasmid-based reactions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 338 (3), 1346-1352 (2005).
- Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
- Hunt, J. P., et al. Streamlining the preparation of “endotoxin-free” ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).
- Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).
- Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
- Bosdriesz, E., Molenaar, D., Teusink, B., Bruggeman, F. J. How fast-growing bacteria robustly tune their ribosome concentration to approximate growth-rate maximization. FEBS Journal. 282 (10), 2029-2044 (2015).
- Zawada, J., Swartz, J. Maintaining rapid growth in moderate-density Escherichia coli fermentations. Biotechnology and Bioengineering. 89 (4), 407-415 (2005).
- Kim, J., Copeland, C. E., Padumane, S. R., Kwon, Y. C. A crude extract preparation and optimization from a genomically engineered Escherichia coli for the cell-free protein synthesis system: Practical laboratory guideline. Methods and Protocols. 2 (3), 1-15 (2019).
- Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli. Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).
- Levine, M. Z., et al. Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-h workflow for cell-free expression. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).
- Martin, R. W., et al. Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids. Nature Communications. , 1-9 (2018).
- Soye, B. J. D., et al. Resource A highly productive, One-pot cell-free protein synthesis platform based on genomically recoded Escherichia coli resource. Cell Chemical Biology. 26 (12), 1743-1754 (2019).
- Ezure, T., Suzuki, T., Ando, E. A cell-free protein synthesis system from insect cells. Methods in Molecular Biology. , 285-296 (2014).
- Heide, C., et al. development and optimization of a functional mammalian cell-free protein synthesis platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1-10 (2021).
