Summary
Das verfeinerte Tail Vein Transection (TVT) Blutungsmodell bei anästhesierten Mäusen ist eine sensitive in vivo Methode zur Beurteilung hämophiler Blutungen. Dieses optimierte TVT-Blutungsmodell verwendet Blutverlust und Blutungszeit als Endpunkte, verfeinert andere Modelle und vermeidet den Tod als Endpunkt.
Abstract
Schwanzblutungsmodelle sind wichtige Werkzeuge in der Hämophilieforschung, insbesondere für die Beurteilung von Prokoagulanzienwirkungen. Das Überlebensmodell der Tail Vein Transection (TVT) wurde in vielen Umgebungen aufgrund der Empfindlichkeit gegenüber klinisch relevanten Dosen von FVIII bevorzugt, während andere etablierte Modelle, wie das Tail-Clip-Modell, höhere Konzentrationen von Prokoagulanzienverbindungen erfordern. Um zu vermeiden, dass das Überleben als Endpunkt verwendet wird, haben wir ein TVT-Modell entwickelt, das Blutverlust und Blutungszeit als Endpunkte und Vollnarkose während des gesamten Experiments festlegt. Kurz gesagt, anästhesierte Mäuse werden mit dem Schwanz in gemäßigte Kochsalzlösung (37 ° C) eingetaucht positioniert und mit der Testverbindung in der rechten lateralen Schwanzvene dosiert. Nach 5 Minuten wird die linke seitliche Schwanzvene mit einer Schablonenführung durchblutet, der Schwanz wird zur Kochsalzlösung zurückgeführt und alle Blutungsepisoden werden überwacht und für 40 Minuten aufgezeichnet, während das Blut gesammelt wird. Wenn nach der Verletzung 10 min, 20 min oder 30 min keine Blutung auftritt, wird das Gerinnsel sanft herausgefordert, indem der Schnitt zweimal mit einem nassen Mulltupfer abgewischt wird. Nach 40 min wird der Blutverlust durch die Menge an Hämoglobin quantifiziert, die in die Kochsalzlösung blutet. Dieses schnelle und relativ einfache Verfahren führt zu konsistenten und reproduzierbaren Blutungen. Im Vergleich zum TVT-Überlebensmodell verwendet es ein humaneres Verfahren, ohne die Empfindlichkeit gegenüber pharmakologischen Eingriffen zu beeinträchtigen. Darüber hinaus ist es möglich, beide Geschlechter zu verwenden, wodurch die Gesamtzahl der Tiere, die gezüchtet werden müssen, unter Einhaltung der Prinzipien von 3R reduziert wird. Eine mögliche Einschränkung bei Blutungsmodellen ist die stochastische Natur der Hämostase, die die Reproduzierbarkeit des Modells verringern kann. Um dem entgegenzuwirken, stellt die manuelle Gerinnselstörung sicher, dass das Gerinnsel während der Überwachung herausgefordert wird, wodurch verhindert wird, dass die primäre (Thrombozyten-) Hämostase die Blutung stoppt. Diese Ergänzung des Katalogs der Blutungsverletzungsmodelle bietet die Möglichkeit, prokoagulantische Effekte auf standardisierte und humane Weise zu charakterisieren.
Introduction
Tiermodelle sind unerlässlich, um die Pathogenese der Hämophilie zu verstehen und Behandlungsschemata und Therapien zu entwickeln und zu testen. Die Faktor-VIII-Knock-out-Maus (F8-KO) ist ein weit verbreitetes Modell zur Untersuchung von Hämophilie A 1,2. Diese Mäuse rekapitulieren Schlüsselmerkmale der Krankheit und wurden häufig für die Entwicklung von Behandlungen wie rekombinanten FVIII-Produkten 3,4,5 und Gentherapiestrategien 6,7 verwendet.
Es gibt verschiedene Blutungsverletzungsmodelle zur Bewertung der pharmakologischen Wirkungen verschiedener hämostatischer Verbindungen in vivo. Eines dieser Gerinnungsmodelle ist das Überlebensmodell der Schwanzvenentransektion bei Mäusen 8,9,10,11,12,13,14, das die Fähigkeit hämophiler Mäuse misst, Exsanguination nach Schwanztransektion zu überleben. Diese Methode wurde vor mehr als vier Jahrzehnten 15 eingeführt und wird immernoch 9,16,17 verwendet. Das Modell nutzt jedoch das Überleben als Endpunkt und erfordert die Beobachtung der Tiere über einen Zeitraum von bis zu 24 Stunden, in dem die Tiere bei Bewusstsein sind und daher Schmerzen und Leiden erfahren können.
Blutungsmodelle mit kürzerer Dauer und unter Vollnarkose wurden bereits beschrieben, wie das Heckclip-Modell (auch bekannt als Schwanzspitze)8,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . Für eine vollständige Normalisierung des Blutverlustes nach der Blutungsherausforderung erfordern diese Modelle jedoch Dosen von Prokoagulanzien (z. B. FVIII), die weit höher sind als die klinischverabreichten 29. Ein anderes Verletzungsmodell unter Narkose, die Vena-Saphena-Blutungsmethode, ist empfindlich gegenüber niedrigeren Dosen von Prokoagulanzienverbindungen30, erfordert jedoch ein hohes Maß an Experimentatorintervention, da die Gerinnsel häufig gestört werden müssen (im Gegensatz zu 3 Mal im vorgestellten Modell).
Die Standardisierung hin zu einem gemeinsamen Protokoll zur Prüfung neuer Prokoagulanzienverbindungen würde den Datenvergleich zwischen Laboratorienerheblich erleichtern 31,32,33. In TVT-Modellen gibt es noch keine gemeinsame Übereinstimmung über die untersuchten Endpunkte (Blutverlust 7,26, Blutungszeit9,34 und Überlebensrate35,36), und die experimentelle Länge variiert zwischen den Studien13.
Unser primäres Ziel ist es, ein optimiertes Modell mit hoher Reproduzierbarkeit, der Möglichkeit, On-Demand sowie eine prophylaktische Behandlung zu untersuchen, der Empfindlichkeit gegenüber pharmakologischen Interventionen, die dem Überlebensmodell entsprechen, zu beschreiben und zu charakterisieren, jedoch nicht den Tod oder den Nahtod als Endpunkte zu verwenden. Um Schmerzen und Leiden zu lindern, sollten die Tiere während der Blutung nicht bei Bewusstsein sein und ein ethischerer Endpunkt muss implementiertwerden 37.
Heckclip-Modelle werden im Allgemeinen in einer von zwei Varianten durchgeführt, entweder mit Amputation der Schwanzspitze, z. B. Amputation von 1-5 mm18,19,20,21,23,24 oder, in einer schwereren Variante, bei einem Heckdurchmesser um 1-3 mm 8,22,25 . Dies verursacht eine kombinierte arteriovenöse Blutung, da die lateralen und dorsalen Venen und die ventrale Arterie normalerweise durchtrennt sind, und im Allgemeinen gilt: Je größer die Amputation, desto geringer ist die Empfindlichkeit gegenüber einer Prokoagulansverbindung. Da die Schwanzspitze amputiert ist, ist die arteriovenöse Verletzung ohne Gegengewebe freigelegt; Daher ist es, zumindest in der Theorie, den häufigsten hämophilen Blutungen unähnlich.
Wie der Name schon sagt, wird nur die Vene bei Schwanzvenentranssektionsmodellen, wie sie in dieser Arbeit beschrieben sind, verletzt, was zu einer ausschließlich venösen Blutung führt. Da das Gefäß nicht vollständig durchtrennt ist, wird erwartet, dass die Verletzung kleiner ist als bei den Amputationsmodellen, und das Gewebe um den Schnitt, an dem ein Gerinnsel haften kann, bleibt erhalten. Darüber hinaus gibt es einen niedrigeren Blutdruck in der Vene im Gegensatz zur Arterie. Diese Faktoren tragen zu einer erhöhten Sensitivität im Vergleich zu Amputationsmodellen bei, so dass eine Normalisierung der Blutung mit klinisch relevanten Dosen der Ersatztherapie erreicht werden kann, z. B. mit rFVIII bei Hämophilie A, was für die Beurteilung des Ausmaßes und der Haltbarkeit der Wirkungen der Prokoagulanzienbehandlungnützlich ist 26,38,39.
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Protocol
Alle in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren wurden von der Tierschutzbehörde von Novo Nordisk A/S und der dänischen Tierversuchsinspektion und dem dänischen Ministerium für Ernährung, Landwirtschaft und Fischerei genehmigt. Die optimierte 40-Minuten-Methode beinhaltet Anästhesie und Dosierungszeit im Design (Abbildung 1). Hämophile Mäuse beiderlei Geschlechts im Alter zwischen 10 und 16 Wochen sind für dieses Verfahren erforderlich.
1. Vorbereitungen vor der Studie
- Bereiten Sie die Dosierlösungen in den richtigen Konzentrationen vor.
- Starten Sie das Wasserbad und erwärmen Sie es auf 37 ° C. Füllen Sie die 15 ml Zentrifugenröhrchen zur Blutentnahme mit Kochsalzlösung (0,9% NaCl).
- Legen Sie die 15 ml Kochsalzröhren mindestens 15 Minuten vor Beginn des Experiments in die Löcher in der erwärmten Grundplatte.
- Identifizieren Sie die Mäuse und notieren Sie ihr Gewicht. Vermeiden Sie es, Mäuse mehr als nötig zu handhaben, da dies Stress verursachen und die Studie beeinträchtigen kann.
- Bereiten Sie den Arbeitsplatz im Abzug vor, bevor Sie fortfahren, damit alles in Reichweite ist: Servietten, Schwanzhalter, Gaze, Spritzen, Skalpelle, Stoppuhren und Blutfluss-Notationspapier.
- Legen Sie die Heckmarkierung und die Schneidblöcke auf die Heizplatte - kalte Blöcke führen dazu, dass sich die Venen zusammenziehen und dadurch die Blutung beeinflussen.
2. Anästhesie
- Führen Sie das Isofluran-Anästhesieverfahren in einem Abzug durch.
- Stellen Sie den Gasverdampfer zunächst auf 5% Isofluran in 30% O 2/70% N2O in der Anästhesiekammer mit 1 L/min Durchfluss ein. Planen Sie ausreichend Zeit für die Befüllung der Anästhesiekammer ein (ca. 5 min, abhängig vom Kammervolumen und dem Gasdurchfluss). Sorgen Sie für eine schnelle Induktion (weniger als eine Minute).
- Legen Sie die Mäuse in die Anästhesiekammer, bis sie das Bewusstsein verlieren.
HINWEIS: Dies sollte innerhalb einer Minute oder weniger geschehen, wenn die Kammer ausreichend gefüllt ist. - Stellen Sie eine ordnungsgemäße Anästhesie sicher, indem Sie keine schmerzhafte Reaktion auf den Pedalreflex (feste Zehenklemme) haben.
- Legen Sie die Mäuse auf die Heizplatte und stellen Sie sicher, dass sich die Nase im Nasenkegel befindet.
- Reduzieren Sie die Anästhesie auf ein Erhaltungsniveau von 2% Isofluran in 30% O 2/70% N2O und legen Sie eine Kunststoffabdeckung über die Mäuse, um den Wärmeverlust zu reduzieren. Tragen Sie eine geeignete Augensalbe auf, um Trockenheit unter Narkose zu verhindern.
- Markieren Sie das Heck mit einem Durchmesser von 2,5 mm mit dem Heckmarkierungsblock. Zwingen Sie den Schwanz nicht in den Schlitz im Block - er muss eng anliegen (Ergänzende Abbildung 1)
- Legen Sie den Schwanz für mindestens 5 Minuten in den Kochsalzschlauch, um eine warme Schwanzvene zu gewährleisten, die für die intravenöse (intravenöse) Dosierung optimal ist.
3. Dosierung der Testlösung
- Legen Sie eine Maus in den Schwanzhalter mit der Nase in eine Anästhesiemaske.
- Dosieren Sie das Tier mit der interessierenden Verbindung (in diesem Fall rFVIII) und starten Sie sofort die Stoppuhr (t = 0).
- Legen Sie die Maus wieder auf die Heizplatte mit dem Schwanz in das Kochsalzrohr. Wiederholen Sie den Vorgang mit den anderen Mäusen.
4. Durchführung der Tailvenentranssektion
- Führen Sie die Schwanzvenentranssektion genau 5 Minuten nach der Dosierung durch. Legen Sie den Schwanz in den Schneidblock und drehen Sie ihn um 90°, um die Vene freizulegen (Ergänzende Abbildung 2).
- Führen Sie den Schnitt auf der gegenüberliegenden Seite/Vene durch, von der aus die Testlösung dosiert wurde.
- Ziehen Sie die #11 Skalpellklinge durch den Schlitz des Schneidblocks, der den Schwanz hält, um Blutungen zu erzeugen. Setzen Sie die Stoppuhr zurück und bringen Sie das Heck sofort zur Kochsalzlösung zurück.
5. Beobachtungszeit und Herausforderungen
- Beobachten Sie die Blutung und kommentieren Sie den Beginn und das Ende der Blutung während 40 Minuten; Kommentieren Sie es auf dem Blutfluss-Notationspapier.
HINWEIS: Diese visuelle Beurteilung der Blutung kann aufgrund der Subjektivität leicht variieren. - Die Primärblutung muss innerhalb von 3 Minuten nach dem Schnitt aufhören. Wenn dies nicht der Fall ist, disqualifizieren Sie die Maus, euthanasieren und ersetzen Sie sie (wenn die primäre Blutung nicht gestoppt wird, kann dies auf eine zu schwere Verletzung oder fehlende primäre Hämostase hinweisen, wie bei vWF KO-Mäusen).
- Wenn es nach der Verletzung 10 min, 20 min und 30 min keine Blutung gibt, fordern Sie den Schwanzschnitt wie in den Schritten 4-5 beschrieben an.
- Verwenden Sie einen Mulltupfer, der in warmer Kochsalzlösung aus einem separaten Schlauch getränkt ist, der im Wasserbad aufbewahrt wird. Heben Sie den Schwanz aus der Kochsalzlösung und wischen Sie ihn zweimal sanft mit der nassen Gaze in distaler Richtung über den Schwanzschnitt ab.
- Tauchen Sie nach jeder Herausforderung sofort wieder in das Kochsalzrohr ein.
- Stoppen Sie bei t = 40 min die Blutentnahme, indem Sie den Schwanz aus der Kochsalzröhre entfernen.
6. Blutentnahme
- Nach t = 40 min erhalten Sie Blutproben aus der supraorbitalen Vene.
7. Euthanasie
- Euthanasieren Sie die Mäuse durch Zervixdislokation, während sie noch unter Vollnarkose stehen.
8. Behandlung von Proben
- Die 15 ml Blutentnahmeröhrchen mit Kochsalzlösung bei 4000 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
- Entsorgen Sie den Überstand aus den 15-ml-Röhrchen, suspendieren Sie das Pellet in 2-14 ml Erythrozyten-Lysinglösung (RBC) und verdünnen Sie es dann, bis es eine helle Kaffeefarbe erreicht.
- Beachten Sie das Gesamtvolumen (Blutvolumen + Volumen der Erythrozyten (RBC) Lysinglösung, die unter Verwendung der Graduierungsmarkierungen auf der Tube hinzugefügt wird).
- Geben Sie 2 ml der Verdünnung in ein Hämoglobinröhrchen und kühlen Sie es bis zur Hämoglobinanalyse.
- Bestimmen Sie den Blutverlust, indem Sie die Hämoglobinkonzentration in der Kochsalzlösung messen. Messen Sie die Absorption bei 550 nm an einem Mikroplattenleser (Tabelle der Materialien).
- Wandeln Sie die Absorption in nmol-Hämoglobin um, indem Sie eine Standardkurve verwenden, die aus menschlichem Hämoglobin (Materialverzeichnis) hergestellt wird, und korrigieren Sie die Verdünnung mit RBC-Lysinglösung.
9. Statistische Auswertungen
- Analysieren Sie die Daten mit entsprechender Software. Hier wurde die GraphPad Prism Software verwendet. In einer Reihe von Studien wurde festgestellt, dass die folgenden statistischen Methoden gut funktionieren.
HINWEIS: Zur Analyse von Blutverlust, Blutungszeit, Exposition, Thrombozytenzahl und Hämatokrit; Der Brown-Forsythe- und Welch ANOVA-Test wurde verwendet (da die Daten kontinuierlich, aber ohne Varianzhomogenität der Residuen waren), wobei Dunnetts Test angewendet wurde, um mehrere Vergleiche zu ermöglichen. Ein Pearson-Test wurde verwendet, um auf Korrelationen zwischen Blutungszeit, Blutverlust und Dosen zu testen. Um die ED50-Werte zu bestimmen, wurde eine Vier-Parameter-Inverse Log-Wirkungsgleichung (Dosis) an Blutungs- und Blutverlustdaten angepasst. Um den Gender-Effekt zu analysieren, wurde ein Zwei-Wege-ANOVA-Test verwendet, bei dem die Bonferroni-Korrektur angewendet wurde, um mehrere Vergleiche zu ermöglichen. Das Signifikanzniveau wurde als P < 0,05 definiert. Daten werden als Mittel ± REM angezeigt.
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Representative Results
Um die Anwendbarkeit des optimierten Modells zu beurteilen, wurde eine Studie an F8-KO-Mäusen (C57BL genetischer Hintergrund) durchgeführt, denen eine kommerziell erhältliche rekombinante Faktor-VIII-Ersatztherapie (rFVIII) verabreicht wurde. Vier verschiedene Dosen wurden getestet: 1 IE/kg, 5 I.E./kg, 10 I.E./kg und 20 I.E./kg. Darüber hinaus testeten wir die entsprechende Fahrzeugsteuerung (Negativ) in F8-KO-Mäusen und Wildtyp-Mäusen (WT) mit C57BL-Mäusen als Positivkontrollgruppe, um den Ansprechbereich im Modell zu beurteilen.
Nach dem optimierten Protokoll gab es eine signifikante Verringerung des Blutverlustes für rFVIII-Behandlungsgruppen im Vergleich zur Vehikelgruppe. Zusätzlich wurde eine Verkürzung der Blutungszeit in den Behandlungsgruppen 5 I.E./kg, 10 I.E./kg und 20 I.E./kg im Vergleich zur Vehikelgruppe beobachtet (Abbildung 2). Bei WT-Mäusen lag der Gesamtblutverlust zwischen 201,8 und 841,9 nmol Hgb (95% CI) und bei Fahrzeugmäusen zwischen 5335 und 7148 nmol Hgb (95% CI). Nach der ungefähren Äquivalenz von 1000 nmol Hgb ~125 μL Vollblut betrug die mittlere Blutung bei im Fahrzeug behandelten Mäusen 780,25 μL, während in der 20 IE/kg-Gruppe 89,95 μL betrug. So normalisierte eine Dosis von 20 IE/kg die Blutung vollständig, und die Verabreichung von 10 IE/kg verursachte einen signifikanten Effekt, der den Blutverlust fast bis zur oberen Grenze des WT-Bereichs reduzierte (Abbildung 3). Die Blutungszeit von WT-Mäusen lag zwischen 0,98 und 9,16 min (95% CI), und Dosiswerte von 10 IE / kg und 20 IE / kg reduzierten die Blutungszeit auf diesen Bereich. In den kombinierten Daten wurde eine starke Korrelation zwischen Blutverlust und Blutungszeit beobachtet (r = 0,9357, P < 0,0001) (Abbildung 4).
Um die Sensitivität des Modells zu bewerten, wurde eine vier-parametrische inverse logarithmische (Dosis-) Wirkungsgleichung an Blutverlust- und Blutungszeitbeobachtungen angepasst und ein klarer dosisabhängiger Effekt der rFVIII-Verabreichung auf den Blutverlust und für die Blutungszeit beobachtet (Abbildung 3). Die geschätzten ED50-Werte für Blutverlust und Blutungszeit betrugen 2,41 ± 1,69 IE/kg bzw. 2,55 ± 2,80 IE/kg.
Um zu veranschaulichen, wie Blutungen im Modell auftreten, wurden alle aufgezeichneten Blutungsepisoden so dargestellt, dass sie eine Visualisierung der Länge und Anzahl der Blutungen für jede einzelne Maus liefern (Abbildung 5). Die primäre Blutung ist in allen Gruppen sehr ähnlich. Der größte Teil der hämophilen Fahrzeuggruppe beginnt vor der zweiten Herausforderung nach 20 Minuten erneut zu bluten, und bei etwa der Hälfte dieser Tiere hört die Blutung nach der ersten Herausforderung nicht auf. Schließlich, wie beschrieben, reduzierte die rFVIII-Behandlung die Länge der Blutungsepisoden bei behandelten F8-KO-Mäusen im Vergleich zum Vehikel, wobei bereits eine beobachtbare Veränderung bei der niedrigsten Dosis zu beobachten war. Bei den höchsten Dosisstufen bluteten die meisten Mäuse nur kurz, nachdem sie herausgefordert worden waren.
Die rFVIII-Plasmakonzentration wurde mittels Luminescent Oxygen Channeling Assay (LOCI) gemessen, der hFVIII und Analoga nachweiste, um zu überprüfen, ob der beobachtete Effekt bei der Verringerung des Blutverlusts und der Blutungszeit konzentrationsabhängig war (Abbildung 6). Es gibt Variabilität innerhalb jeder Gruppe (mittlerer CV 46%), aber dennoch können signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen beobachtet werden, was bestätigt, dass der beobachtete Effekt bei Blutverlust und Blutungszeit von der Plasmakonzentration von FVIII abhängt. Alle im Fahrzeug behandelten Mäuse, die unterhalb der unteren Quantifizierungsgrenze für den Assay (2 E/L) gemessen wurden und mit diesem Wert dargestellt werden. WT-Mäuse wurden nicht gemessen, da der angewandte FVIII-Assay spezifisch für den Nachweis von humanem FVIII ist.
Die Thrombozytenzahl und der Hämatokrit wurden für alle Gruppen unter Verwendung der nach der Blutung entnommenen Blutproben bestimmt (Abbildung 7 und mit einem hämatologischen Analysator (Materialtabelle) gemessen. Es gab keine Variation zwischen den Gruppen in der Thrombozytenzahl, was darauf hindeutet, dass die Thrombozytenzahlen nicht betroffen sind und die Mäuse daher weiterhin zur primären Hämostase fähig sind. Für Hämatokritmessungen wurden normale Werte bei Tieren beobachtet, die moderate und höhere FVIII-Dosen erhielten (5 I.E./kg, 10 I.E./kg und 20 I.E./kg), während in den Vehikel- und 1 I.E./kg behandelten Gruppen (im Vergleich zu WT-Tieren) signifikant niedrigere Werte beobachtet wurden. Dies ist eine häufige Beobachtung bei hämophilen Tieren nach starken Blutungen.
Klassischerweise wurde in Tierversuchen nur ein Tiergeschlecht (typischerweise männlich) verwendet, und dies wird auch für TVT-Überlebensmodelle 8,9,11,12 beschrieben. Um die Gesamtzahl der hämophilen Mäuse zu reduzieren, die in zukünftigen Studien (für die Zucht und die Studie) benötigt werden, wurden beide Geschlechter verwendet. Um den Effekt des Geschlechts in diesem optimierten Modell zu bewerten (Abbildung 8), wurden sowohl die Ergebnisse des Blutverlusts als auch der Blutungszeit einer bidirektionalen ANOVA-Analyse mit Geschlecht und Dosis als Faktoren unterzogen. In dieser Analyse war die Wirkung der rFVIII-Dosis statistisch signifikant (P < 0,0001), aber das Geschlecht der Maus beeinflusste die Ergebnisse nicht signifikant (P 0,35), und es wurde keine signifikante Wechselwirkung zwischen den Parametern gefunden, was darauf hindeutet, dass sich die Reaktionen auf die Behandlung nicht zwischen den Geschlechtern unterschieden.
Abbildung 1: Zeitlicher Aufbau des Versuchsaufbaus. Die Phase vor der Schwanzvenentransektion (TVT) umfasst die Induktion der Anästhesie, die Erwärmung des Schwanzes in Kochsalzlösung und die Dosierung. Nach der TVT-Verletzung werden 40 Minuten lang die Blutung unter Narkose überwacht, mit anschließenden Herausforderungen alle 10 Minuten. Das experimentelle Verfahren wird durch die Entnahme von Blutproben und Euthanasie abgeschlossen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Wirkung von rFVIII nach intravenöser Verabreichung. Gesamtblutverlust (linkes Panel) und Gesamtblutungszeit (rechtes Panel) von F8-KO-Mäusen. Jede Maus wird als individuelle Beobachtungen dargestellt und bedeutet ± REM. Die verschiedenen Testdosen von rFVIII sind in der x-Achse dargestellt. Die Daten wurden von Brown-Forsythe und Welch ANOVA unter Anwendung des Dunnett-Tests analysiert, um mehrere Vergleiche zu ermöglichen. P < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Dosis-Wirkungs-Kurven für Blutverlust und Blutungszeit. Blutverlust (linkes Panel) und Blutungszeit (rechtes Panel). Die Grauzone stellt die 95% CI aus den Werten von 6 unbehandelten Wildtyp-C57BL/6-Mäusen dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Korrelationsdiagramm für Blutverlust und Blutungszeit. R2 = 0,8755, P < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Individuelle Blutungsprofile bei Wildtyp-, Fahrzeug-, 1 I.E./kg, 5 I.E./kg, 10 I.E./kg und 20 I.E./kg rFVIII-behandelten Mäusen. Jede Linie stellt das Blutungsprofil einer einzelnen Maus dar, während jeder gepunktete Balken eine Blutungsepisode darstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Exposition gegenüber rFVIII Die FVIII-Konzentration im Plasma wurde mit einem Luminescent Oxygen Channeling Assay (LOCI) zum Nachweis von humanem FVIII gemessen. Fahrzeugmäuse befanden sich unter der unteren Quantifizierungsgrenze (LLOQ) und wurden daher mit dem LLOQ-Wert (2 U/L) aufgetragen. WT-Tiere wurden nicht gemessen, da der angewandte FVIII-Assay spezifisch für den Nachweis von humanem FVIII ist. Die unterschiedlichen Testdosen von rFVIII und einer WT-Kontrolle sind in der x-Achse dargestellt. ** P < 0,01, *** P < 0,001 und **** P < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Hämatologische Daten. Die Thrombozytenzahl (linkes Panel) und der Hämatokrit (rechte Tafel) von F8-KO-Mäusen werden als Einzelbeobachtungsmittelwert mit REM dargestellt. Die verschiedenen Testdosen von rFVIII und einer WT-Kontrolle werden auf der x-Achse dargestellt. Die Daten wurden von Brown-Forsythe und Welch ANOVA unter Anwendung des Dunnett-Tests analysiert, um mehrere Vergleiche zu ermöglichen. ** P < 0,01 und *** P < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 8. Wirkung des Geschlechts. Blutverlust (linkes Panel) und Blutungszeit (rechtes Panel), klassifiziert nach Behandlung, werden als Einzelbeobachtungen mit mittlerer ± REM dargestellt. Die Daten wurden von einer bidirektionalen ANOVA analysiert, die die Bonferroni-Korrektur anwendete, um mehrere Vergleiche zu ermöglichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| ED50 Blutungszeit (IU/kg) | ED50 Blutverlust (IE/kg) | ED50-Überleben (IE/kg) | ||
| Modelle unter Narkose | Optimiertes Modell der Heckvenentranssektion | 2,6 ± 2,8 | 2,4 ± 1,7 | nicht relevant |
| Vena Saphena Modell30 | 8.1 ± 2.2 | 5.1 ± 2.1 | nicht relevant | |
| Moderater Heckclip (L=3mm)27 | nicht gemeldet | 4,6 ± 0,5 | nicht relevant | |
| Moderater Heckclip (L=4mm)28 | 39 | 28 | nicht relevant | |
| Moderater Heckclip (L=4mm)20 | nicht gemeldet | 53 | nicht relevant | |
| Überlebensmodelle | Überlebensmodell der Heckvenentransektion36 | nicht gemeldet | nicht gemeldet | 58 |
| Überlebensmodell der Schwanzvenentransektion Modell10 | nicht gemeldet | nicht gemeldet | 21 |
Tabelle 1: ED50 Werte. Vergleich vonED-50-Werten verschiedener verfügbarer Blutungsmodelle für Hämophilie-Studien an Mäusen. Die Daten werden aus zitierten Artikeln extrahiert [Referenzen hochgestellt] und als ED50 (IU/kg) dargestellt.
Ergänzende Abbildung 1: Messvorlage. Hergestellt aus Aluminium. Größenangaben: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Nut: 2,5 mm Tiefe und 2,5 mm Breite; Radius 1,25 mm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Schnittvorlage. Hergestellt in Edelstahl. Größenangaben: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Nut: 3 mm Tiefe und 3 mm Breite; Radius 1,5 mm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Diese optimierte Methode der Schwanzvenentransektion (TVT) hat mehrere Vorteile gegenüber der TVT-Überlebensmethode. Die Tiere werden während der gesamten Studiendauer vollständig betäubt, was die Handhabung der Maus erleichtert und das Wohlbefinden der Tiere erhöht. Darüber hinaus ist im Gegensatz zum TVT-Überlebensmodell keine Beobachtung über Nacht erforderlich, und dieses optimierte Modell bietet die Möglichkeit, den Blutverlust zu messen und die genaue Blutungszeit über 40 Minuten zu beobachten. Auch längere Blutungsperioden bei bewussten Tieren können zum Tod durch Exsanguination führen, was zu Schmerzen und Leiden bei den Tieren und wahrscheinlich zu Stress führt, was möglicherweise zu einer erhöhten Variationführt 14. Blutverlust und Blutungszeit wurden erfolgreich als Endpunkte charakterisiert und validiert, die die Zeit bis zum Tod oder Beinahe-Tod ersetzen. Die tatsächliche Heckverletzung ist gut definiert und standardisiert, da sie eine Schneidblockführung verwendet, um die TVT durchzuführen, wodurch ein reproduzierbarer Schnitt gesichert wird, wodurch die Schwierigkeit des Verfahrens und die technische Variabilität reduziert werden. Dadurch kann eine höhere Modellrobustheit erreicht werden, wodurch die Anzahl der benötigten Tiere reduziert wird. Darüber hinaus haben die Daten gezeigt, dass es möglich ist, sowohl männliche als auch weibliche Mäuse zu verwenden, wodurch die Gesamtzahl der zu züchtenden Tiere gemäß den 3R-Prinzipien reduziert wird. Zusammen mit diesen Beobachtungen gibt es einen Trend, dass weibliche Mäuse in Gruppen mit hohen Blutungen etwas weniger bluten und etwas stärker variieren, aber nicht in Gruppen mit niedriger Blutung. Niedrigere Blutverlustmessungen könnten mit Frauen in Verbindung gebracht werden, die eine kleinere Größe und daher ein geringeres Blutvolumen im Vergleich zu Männern gleichen Alters haben.
Spontane Blutungen bei hämophilen Patienten sind in der Regel intern, insbesondere bei Muskel-Skelett-, Weichteil- und mukokutanen Blutungen, während äußere Verletzungen (wie geringfügige Schnitte) nicht die häufigste Ursache für ausgedehnte Blutungen sind, obwohl schwerere Schnitte und Traumata lebensbedrohlich seinkönnen 40,41. Dieses optimierte Modell induziert nur venöse Blutungen, während andere Modelle, wie der Schwanzclip, eine Mischung aus arterio-venösen Blutungen induzieren. Da es sich bei dem beschriebenen Modell um ein reines Venenmodell handelt, spiegelt der Dosis-Effekt des Prokoagulans in diesem TVT-Modell möglicherweise nicht den Effekt bei einer schwereren arteriellen Verletzung wider. Daher sollten andere Blutungsmodelle verwendet werden, wenn solche Blutungen im Fokus stehen.
Wie das individuelle Blutungsprofil zeigt, ist die primäre Blutung in allen Gruppen sehr ähnlich, was darauf hindeutet, dass die primäre Hämostase, d.h. die Aggregation von aktivierten Blutplättchen, in der Hämophilie-A-Einstellung42 intakt ist. Bei einer immobilisierten Verletzung, selbst bei schwerer Hämophilie, kann die Thrombozytenaggregation ausreichen, um Blutungen abzuschwächen. Aus diesem Grund haben wir durch empirische Studien herausgefunden, dass die Induktion einer Blutungsherausforderung alle 10 Minuten ein notwendiger Schritt im Protokoll ist, um Aggregate von aktivierten Blutplättchen zu stören, die stark genug sein können, um Blutungen auch ohne die Fibrinerzeugung aus der funktionellen Koagulation zu verhindern. Da sich vollständig betäubte Mäuse nicht bewegen und die Verletzung nicht physisch herausfordern können, wie es im nicht betäubten TVT-Überlebensmodell der Fall ist, war es notwendig, die Herausforderungsschritte einzuführen, um zu verhindern, dass die Thrombozytenaggregation allein die Blutung abschwächt. Einige unbehandelte hämophile Mäuse bluten spontan vor der Herausforderung erneut, aber nach der ersten Herausforderung treten bei den meisten unbehandelten hämophilen Mäusen spontane erneute Blutungen auf, und nach der zweiten Herausforderung bluten viele kontinuierlich bis zum Ende des Experiments. Wie erwartet, kam es bei F8-KO-Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen zu erhöhten Blutungen. Mäuse, die mit erhöhten Dosen von rFVIII behandelt wurden, zeigten eine dosisabhängige Verringerung sowohl des Blutverlustes als auch der Blutungszeit. Eine signifikante Wirkung auf die Blutung wurde bei Dosen von 5 I.E./kg und mehr beobachtet (im Vergleich zu im Vehikel behandelten Mäusen). Die beiden höchsten Dosen reduzierten die Blutung auf ein Niveau, das der Wildtyp-Blutungsreaktion ziemlich nahe kommt, was auf eine Normalisierung oder Beinahe-Normalisierung der Blutung hinweist.
In Tabelle 1 zeigen wir einen Vergleich verschiedener ED50-Werte für mehrere Blutungsmodelle, klassifiziert nach den untersuchten Endpunkten. In diesem optimierten Modellbeobachteten wir vergleichbare ED 50-Werte für Blutverlust und Blutungszeit (2,4 ± 1,7 IE/kg bzw. 2,6 ± 2,8 IE/kg). Unter Verwendung desselben Modells, das rFVIIa untersuchte, betrugen die ED50-Werte für Blutverlust und Blutungszeit 0,42 mg / kg bzw.0,39 mg / kg bzw. 38. Dies ist eine größere Empfindlichkeit gegenüber pharmakologischen Interventionen als zuvor beschriebene Blutungsmodelle unter Narkose, wie das Schwanzclip-Modell, mit FVIII ED50 für einen Blutverlust von 4,6 ± 0,5 IE / kg27, 28 IE / kg 28 und 53 IE / kg20. Darüber hinaus gibt es eine hohe Variabilität der ED 50-Werte in den verschiedenen Heckclip-Modellen20,27,28. Ein weiteres Modell unter Narkose ist das schwere Heckclip-Modell. Es ist eine schnellere Methode, da der Beobachtungszeitraum nur 20 Minuten beträgt, aber es ist weniger empfindlich gegenüber Prokoagulanzienaktivität. Dosen von mehr als 200 IE/kg FVIII waren notwendig, um eine statistisch signifikante Verringerung des Blutverlustes im Vergleich zu fahrzeugbehandelten Tierenzu erreichen 25. Im Vena-Saphena-Modell30 betrug der ED50-Wert für die Blutungszeit 8,1 ± 2,2 IE / kg und ED50 für den durchschnittlichen Blutverlust betrug 5,1 ± 2,1 IE / kg, ebenfalls weniger empfindlich als unser verfeinertes Modell in Bezug auf beide Parameter. Darüber hinaus erfordert dieses Modell empfindliche Arbeiten zur Durchführung der Gefäßverletzung und mehrere wiederholte Eingriffe, die, wenn sie nicht reproduzierbar durchgeführt werden, das Ergebnis beeinflussen könnten.
Im traditionellen TVT-Überlebensmodell wird das Überleben für einen Zeitraum von 24 h nach der Dosierung bewertet, in dem jederzeit Blutungen oder erneute Blutungen auftreten können. Daher erfordert die Wirksamkeit im TVT-Überlebensmodell, dass die prokoagulantische Wirkung der Behandlung mindestens für den größten Teil des 24-stündigen Beobachtungszeitraums anhält. In der hier vorgestellten Methode bewerten wir akute Wirkungen zwischen 5 min und 40 min nach der Dosierung; Daher ist ein direkter Vergleich derED-50-Werte schwierig, da in den Überlebensmodellen höhere Dosen erforderlich sind, um die hämostatische Abdeckung während des letzten Teils des Beobachtungszeitraums aufrechtzuerhalten. Auf Wunsch kann das optimierte TVT-Modell jedoch verwendet werden, um die Dauer der hämostatischen Abdeckung zu bewerten, indem eine Verzögerung zwischen der Dosierung und dem Blutungsverfahren eingeführt wird. Dies wurde für eine frühere Version unseres optimierten TVT-Modells beschrieben, bei der die Durchführung der TVT 24 h nach der Dosierung zu einem ED50 von etwa 10-15 IE/kg für unmodifizierte rFVIII26 führte. Wie in Tabelle 1 erwähnt, wurden in Tail-Transsection-Modellen mit einem 24-h-Überleben als Endpunkt ED-50-Werte von 21 IE/kg 9 und 58 IE/kg36 rFVIII berichtet. In ähnlicher Weise erfordern die Tail-Clip-Überlebensmodelle8 auch höhere Prokoagulanziendosen als ihre akuten Gegenstücke.
Perspektivisch wurden mehrere verschiedene Gerinnungsfaktoren (FVIII, FVIIa, FIX) und Derivate, von denen einige jetzt vermarktet werden, mit dem optimierten Modell unter Verwendung verschiedener hämophiler Mausstämme 26,38,43,44,45,46,47 bewertet. Wir waren auch in der Lage, das Modell an die Untersuchung von On-Demand-Interventionen anzupassen, indem wir nach der Transsektion, kurz vor der ersten Herausforderung, dosierten. Darüber hinaus haben wir dieses Modell erfolgreich verwendet, um bispezifische Antikörper mit Prokoagulanzienaktivität zu bewerten (Østergaard et al., zur Veröffentlichung in Blood angenommen) und dabei die Herausforderungen der Kreuzreaktivität von Spezies durch die Dosierung von humanem FIX und humanem FX zu überwinden. Dies zeigt die Vielseitigkeit und den translationalen Wert des Modells bei der Entwicklung neuer Medikamente im Bereich der Hämophilie, wie z. B. auf Thrombozyten ausgerichtete Strategien48. AAV-basierte oder Genom-Editing-Strategien können auch in Fällen evaluiert werden, in denen es ein Surrogat gibt, das pharmakologisch in Mäusen aktiv ist. Daher ist dieses optimierte TVT-Blutungsmodell eine Alternative zu den Überlebensmodellen für die Heckvenentransektion und den Schwanzclip sowie eine wertvolle Alternative zu anderen Blutungsmodellen unter Narkose. Dieses Modell ist humaner im Vergleich zum Überlebensmodell und ein Beispiel für Verfeinerung, da die Tiere keine Schmerzen und Leiden erfahren. Aus unserer Sicht sind die Sensitivität gegenüber klinisch relevanten Dosisniveaus, die relative technische Einfachheit und die Vermeidung von Tod/Nahtod als Endpunkte wesentliche Vorteile.
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Disclosures
Die Autoren sind oder waren Mitarbeiter und/oder Aktionäre von Novo Nordisk A/S zum Zeitpunkt der Durchführung dieser Studie.
Acknowledgments
Esther Bloem und Thomas Nygaard sind für ihre Unterstützung bei Messungen von FVIII im Plasma anerkannt. Bo Alsted ist für das Zeichnen und Bearbeiten der Schablonen und Schneidblöcke anerkannt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #11 Scalpel blade | Swann-Morton | 503 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One, Austria | 188271 | |
| 30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing | BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe | 320830 | |
| Advate | Takeda, Japan | Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII) | |
| Alcohol pads 70% ethanol | Hartmann, Soft-Zellin | 999 979 | |
| Centrifuge | Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech | ||
| Cutting template (Stainless steel) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm | |
| Erythrocytes (RBC) lysing solution | Lysebio, ABX Diagnostics | 906012 | |
| Gauze | |||
| Haematological analyser | Sysmex | CT-2000iv | |
| Heating lamp on stand | Phillips | IR250 | |
| Heating pad with thermostat | CMA | model 150 | |
| Hemoglobin standards and controls - 8.81 mmol / l batch dependent | HemoCue, Denmark | HemoCue calibrator, 707037 | Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH). |
| Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box | Sigma Delta Dameca | ||
| Isoflurane | Baxter | 26675-46-7 | |
| Magnifier with lights | Eschenbach | ||
| Measuring template (Aluminum) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm | |
| Micropipettes + tips | Finnpipette | ||
| Photometer | Molecular Devices Corporation, CA, USA | SpectraMax 340 photometer | |
| Prism Software | GraphPad, San Diego, CA, USA | Version 9.0.1 | |
| Saline 0.9% NaCl | Fresenius Kabi, Sweden | 883264 | |
| Special tail marker block for TVT tail cut | |||
| Tail holder | |||
| Vacuum liquid suction | Vacusafe comfort, IBS | ||
| Waterbath and thermostat | TYP 3/8 Julabo |
References
- Bi, L., et al. Targeted disruption of the mouse factor VIII gene produces a model of haemophilia A. Nature Genetics. 10 (1), 119-121 (1995).
- Bi, L., et al. Further characterization of factor VIII-deficient mice created by gene targeting: RNA and protein studies. Blood. 88 (9), 3446-3450 (1996).
- Stennicke, H. R., et al. A novel B-domain O-glycoPEGylated FVIII (N8-GP) demonstrates full efficacy and prolonged effect in hemophilic mice models. Blood. 121 (11), 2108-2116 (2013).
- Shapiro, A. D. Anti-hemophilic factor (recombinant), plasma/albumin-free method (octocog-alpha; ADVATE) in the management of hemophilia A. Vascular Health and Risk Management. 3 (5), 555-565 (2007).
- Recht, M., et al. Clinical evaluation of moroctocog alfa (AF-CC), a new generation of B-domain deleted recombinant factor VIII (BDDrFVIII) for treatment of haemophilia A: demonstration of safety, efficacy, and pharmacokinetic equivalence to full-length recombinant factor VIII. Haemophilia. 15 (4), 869-880 (2009).
- Miao, C. H., et al. CD4+FOXP3+ regulatory T cells confer long-term regulation of factor VIII-specific immune responses in plasmid-mediated gene therapy-treated hemophilia mice. Blood. 114 (19), 4034-4044 (2009).
- Milanov, P., et al. Engineered factor IX variants bypass FVIII and correct hemophilia A phenotype in mice. Blood. 119 (2), 602-611 (2012).
- Dumont, J. A., et al. Prolonged activity of a recombinant factor VIII-Fc fusion protein in hemophilia A mice and dogs. Blood. 119 (13), 3024-3030 (2012).
- Pan, J., et al. Enhanced efficacy of recombinant FVIII in noncovalent complex with PEGylated liposome in hemophilia A mice. Blood. 114 (13), 2802-2811 (2009).
- Liu, T., et al. Improved coagulation in bleeding disorders by Non-Anticoagulant Sulfated Polysaccharides (NASP). Journal of Thrombosis and Haemostasis. 95 (1), 68-76 (2006).
- Brooks, A. R., et al. Glycoengineered factor IX variants with improved pharmacokinetics and subcutaneous efficacy. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (9), 1699-1706 (2013).
- Baru, M., et al. Factor VIII efficient and specific non-covalent binding to PEGylated liposomes enables prolongation of its circulation time and haemostatic efficacy. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 93 (6), 1061-1068 (2005).
- Molina, E. S., Fujita, A., Sogayar, M. C., Demasi, M. A. A quantitative and humane tail bleeding assay for efficacy evaluation of antihaemophilic factors in haemophilia A mice. Haemophilia. 20 (6), 392-398 (2014).
- Broze, G. J., Yin, Z. F., Lasky, N. A tail vein bleeding time model and delayed bleeding in hemophiliac mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 85 (4), 747-748 (2001).
- Dejana, E., Callioni, A., Quintana, A., de Gaetano, G. Bleeding time in laboratory animals. II - A comparison of different assay conditions in rats. Thrombosis Research. 15 (1-2), 191-197 (1979).
- Girard, T. J., Lasky, N. M., Grunz, K., Broze, G. J. Suppressing protein Z-dependent inhibition of factor Xa improves coagulation in hemophilia A. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 17 (1), 149-156 (2019).
- Zhang, J. P., et al. Curing hemophilia A by NHEJ-mediated ectopic F8 insertion in the mouse. Genome Biology. 20 (1), 276 (2019).
- Sambrano, G. R., Weiss, E. J., Zheng, Y. W., Huang, W., Coughlin, S. R. Role of thrombin signalling in platelets in haemostasis and thrombosis. Nature. 413 (6851), 74-78 (2001).
- Tranholm, M., et al. Improved hemostasis with superactive analogs of factor VIIa in a mouse model of hemophilia A. Blood. 102 (10), 3615-3620 (2003).
- Mei, B., et al. Rational design of a fully active, long-acting PEGylated factor VIII for hemophilia A treatment. Blood. 116 (2), 270-279 (2010).
- Karpf, D. M., et al. Prolonged half-life of glycoPEGylated rFVIIa variants compared to native rFVIIa. Thrombosis Research. 128 (2), 191-195 (2011).
- Ivanciu, L., et al. A zymogen-like factor Xa variant corrects the coagulation defect in hemophilia. Nature Biotechnology. 29 (11), 1028-1033 (2011).
- Ostergaard, H., et al. Prolonged half-life and preserved enzymatic properties of factor IX selectively PEGylated on native N-glycans in the activation peptide. Blood. 118 (8), 2333-2341 (2011).
- Maroney, S. A., et al. Absence of hematopoietic tissue factor pathway inhibitor mitigates bleeding in mice with hemophilia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3927-3931 (2012).
- Holmberg, H. L., Lauritzen, B., Tranholm, M., Ezban, M. Faster onset of effect and greater efficacy of NN1731 compared with rFVIIa, aPCC and FVIII in tail bleeding in hemophilic mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 7 (9), 1517-1522 (2009).
- Johansen, P. B., Tranholm, M., Haaning, J., Knudsen, T. Development of a tail vein transection bleeding model in fully anaesthetized haemophilia A mice - characterization of two novel FVIII molecules. Haemophilia. 22 (4), 625-631 (2016).
- Ferrière, S., et al. A hemophilia A mouse model for the in vivo assessment of emicizumab function. Blood. 136 (6), 740-748 (2020).
- Elm, T., et al. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of a new recombinant FVIII (N8) in haemophilia A mice. Haemophilia. 18 (1), 139-145 (2012).
- Björkman, S. Prophylactic dosing of factor VIII and factor IX from a clinical pharmacokinetic perspective. Haemophilia. 9, Suppl 1 101-108 (2003).
- Pastoft, A. E., et al. A sensitive venous bleeding model in haemophilia A mice: effects of two recombinant FVIII products (N8 and Advate). Haemophilia. 18 (5), 782-788 (2012).
- Saito, M. S., et al. New approaches in tail-bleeding assay in mice: improving an important method for designing new anti-thrombotic agents. International Journal of Experimental Pathology. 97 (3), 285-292 (2016).
- Liu, Y., Jennings, N. L., Dart, A. M., Du, X. J. Standardizing a simpler, more sensitive and accurate tail bleeding assay in mice. World Journal of Experimental Medicine. 2 (2), 30-36 (2012).
- Greene, T. K., et al. Towards a standardization of the murine tail bleeding model. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (12), 2820-2822 (2010).
- Cerullo, V., et al. Correction of murine hemophilia A and immunological differences of factor VIII variants delivered by helper-dependent adenoviral vectors. Molecular Therapy. 15 (12), 2080-2087 (2007).
- Shi, Q., et al. Factor VIII ectopically targeted to platelets is therapeutic in hemophilia A with high-titer inhibitory antibodies. Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1974-1982 (2006).
- Parker, E. T., Lollar, P. A quantitative measure of the efficacy of factor VIII in hemophilia A mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 89 (3), 480-485 (2003).
- Stokes, W. S. Reducing Unrelieved Pain and Distress in Laboratory Animals Using Humane Endpoints. ILAR Journal. 41 (2), 59-61 (2000).
- Stagaard, R., et al. Abrogating fibrinolysis does not improve bleeding or rFVIIa/rFVIII treatment in a non-mucosal venous injury model in haemophilic rodents. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (7), 1369-1382 (2018).
- Stagaard, R., et al. Absence of functional compensation between coagulation factor VIII and plasminogen in double-knockout mice. Blood Advances. 2 (22), 3126-3136 (2018).
- Bolton-Maggs, P. H., Pasi, K. J.
- Lloyd Jones, M., Wight, J., Paisley, S., Knight, C. Control of bleeding in patients with haemophilia A with inhibitors: a systematic review. Haemophilia. 9 (4), 464-520 (2003).
- Sixma, J. J., vanden Berg, A. The haemostatic plug in haemophilia A: a morphological study of haemostatic plug formation in bleeding time skin wounds of patients with severe haemophilia A. British Journal of Haematology. 58 (4), 741-753 (1984).
- Proulle, V., et al. Recombinant activated factor VII-induced correction of bleeding tendency in genetically engineered von Willebrand disease type 2B mice evaluated using new tail transection bleeding models. International Society on Thrombosis and Haemostasis Congress. , (2017).
- Rode, F., et al. Preclinical pharmacokinetics and biodistribution of subcutaneously administered glycoPEGylated recombinant factor VIII (N8-GP) and development of a human pharmacokinetic prediction model. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (6), 1141-1152 (2018).
- Holmberg, H., et al. GlycoPEGylated rFVIIa (N7-GP) has a prolonged hemostatic effect in hemophilic mice compared with rFVIIa. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (5), 1070-1072 (2011).
- Kawecki, C., et al. Posters Abstracts - Thrombin-mediated Activation of Factor VIII is Insufficient to Produce All Necessary Cofactor Activity in vivo. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 3, 1 (2019).
- Johansen, P., et al. In vivo effect of recombinant FVIIA (NOVOSEVEN®) and RFIX in a refined tail vein transection bleeding model in mice with haemophilia A and B: PO147-MON. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13, (2015).
- Enoksson, M., et al. Enhanced potency of recombinant factor VIIa with increased affinity to activated platelets. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (1), 104-113 (2020).
